人胎盘的体外研究模型及其应用进展

李婷婷，刘海燕，谢建忠，蒋学华，王 凌

(1.西双版纳傣族自治州人民医院药剂科，云南景洪 666100;2.四川大学华西药学院临床药学与药事管理学系，四川成都 610041)

胎盘由胎儿的绒毛膜与母体的底蜕膜共同构成，是妊娠期间胎儿与母体联系的重要器官，担负着物质交换、代谢、分泌和屏障等生理功能。位于母体血液循环和胚胎循环之间的滋养层细胞、毛细血管内皮细胞以及二者间的基膜能阻止一些外来化合物由母体进入胚胎，起到一定的生理屏障的功能，称胎盘屏障。既往一般认为胎盘屏障功能仅依赖于生物膜的半透性，近年的研究揭示，胎盘上同时存在细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)超家族、P－糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)、乳腺癌(干细胞)耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、有机阴离子转运肽(organic anion transporting polypeptides，OATP)、有机阳离子转运蛋白(organic cation transporter，OCT)和单羧基酸转运蛋白(monocarboxylate transporter，MCT)等多种代谢酶和转运蛋白［1］，共同决定母体化合物是否能通过胎盘进入胎儿循环，因此，仅依赖药物基本生化特征难以准确预测其胎盘透过率。然而，了解药物的胎盘屏障透过能力对妊娠期用药至关重要，使用易透过胎盘屏障的药物可能影响胎儿的生长发育，甚至造成畸形和死胎;另一方面，若母体严重疾病得不到及时有效的治疗同样影响胎儿的发育，因此，预测药物的胎盘透过性能意义深远。

随着现代医学的发展，胎儿宫内治疗已成为降低围产儿死亡率以及提高了新生儿生存质量的一种重要手段。在宫内治疗的众多方法中，通过母体给药进行药物治疗具有安全、无创和简便等优点，广泛适用于宫内胎儿各种感染性疾病、内分泌疾病和心律失常等疾病的治疗［2－3］。然而，胎盘屏障是很多药物进入胎儿血液循环发挥治疗作用的一大障碍，不同药物透过胎盘的性能不同，在选用药物时考虑其透过胎盘的能力是治疗成功与否的关键。基于胎盘上分布的众多转运体和代谢酶是药物胎盘屏障的重要物质基础［4］，使用药学或其他方法干预其功能或表达可能是经母体给药进行胎儿宫内治疗的一个新策略。

受医学伦理和研究方法的限制，目前我国药物胎盘转运机制及其干预策略方面的研究尚处于初始阶段。然而，研究胎盘药物转运意义重大，不仅可以指导妊娠期合理用药，还能为优化胎儿宫内药物治疗提供科学的依据，有必要对其进行更深入的了解。本文综述了胎盘的发育过程及胎盘小叶灌流、传代细胞系、原代细胞、外植体及绒毛组织块等目前体外研究人胎盘的主要模型及其特点做一概述，以便于有针对性地选择合适的模型进行胎盘研究。

1 胎盘的发育过程及其代谢酶和转运蛋白的表达

胎盘为胚胎和母体子宫之间的一个圆形或椭圆形盘状器官，有两个面，胎儿面光滑，由一条脐带与胚胎相连，母体面粗糙，与子宫内壁紧密接触，其主体部分为树枝状的绒毛组织，绒毛的表层是滋养层上皮，中层为结缔组织和血管。胎盘有两套血液循环，绒毛中血管属胎儿系统，绒毛间隙与蜕膜区的属母体系统。该结构使胎盘能完成其最基本的功能—物质交换:将胚胎发育所需的氧气和营养物质源源不断地从母体供给胎儿，同时将胚胎产生的代谢物运送回母体排出。成熟的胎盘由17～21个胎盘小叶组成，含有滋养层细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、霍夫鲍尔细胞及血细胞等多种细胞成分，表达多种代谢酶及转运蛋白。

胎盘和胎儿都是从同一个细胞——受精卵演变而来，胎盘是胚外结构，胚泡外壁的滋养层细胞是胎盘的早期结构，着床后分化成合体滋养层细胞。胚胎发育至18～20 d时，作为胎盘主要结构的绒毛组织逐渐形成，约在受精后第3周，绒毛内血管逐渐形成开始建立胎儿循环。第6孕周开始，使用三维阴道超声及多普勒血管造影可见母体绒毛间逐渐增强的血流［5］。妊娠3个月左右，胎盘的基本轮廓逐渐形成，但仅有6～10个胎盘小叶，绒毛内血管分支较稀疏，管径也较细。之后数月，其形态和功能逐渐完善，最终发育成成熟胎盘。

研究发现，早在合体滋养细胞阶段，面对母体的刷状缘以及面对胎儿的基底膜上即开始表达多种转运蛋白［6］。按其功能可分为摄取转运蛋白和外排转运蛋白，摄取转运蛋白增加某些大分子物质或营养成分的胎盘透过率，而外排转运蛋白能阻止许多外源性异物进入胎儿循环。胎盘表达的主要摄取转运体包括 OATP4A1，OATP2B1，OCTN2及OCTN1，这些摄取蛋白主要负责从母体血中摄取大分子营养物质，许多药物也通过它们进入胎盘，如口服降糖药二甲双胍即通过OCT3进入胎盘;而P－gp，BCRP和多药耐药相关 蛋 白 2(multidrug resistance－associated protein 2，MRP2)等外排蛋白可将进入胎儿侧的药物重新排入母体侧，是导致众多药物胎盘透过率低的主要原因。其中隶属ATP结合盒(ATP－binding cassette，ABC)转运体家族的P－gp是胎盘表达的一种典型的外排转运蛋白，能阻止许多有害物质及药物透过胎盘，对胚胎的发育起到一定的保护作用［7］。动物实验证实，抑制胎盘上的P－gp显著增加伊维菌素(ivermectin)的致畸性［8］。然而，随着合体滋养层细胞逐渐发育成成熟胎盘，其P－gp的表达量逐渐降低，研究发现，妊娠早期(60～90 d)胎盘表达的P－gp比足月胎盘高约44.8倍［9］。胎盘上表达的各种代谢酶在一定程度上也阻止外源性异物透过胎盘进入胎儿循环。胎盘发育的不同阶段表达的代谢酶不同，第一孕期可能仅少数 CYP代谢酶在mRNA水平有表达［10］。根据目前的研究，胎盘上有功能表达的CYP酶亚型包括CYP1A1，CYP4B1，CYP19以及新近发现的CYP2S1［11－13］。然而，这些代谢酶的表达受众多因素的调节，如近期的研究发现，母亲肥胖可导致胎盘上CYP1A1 的表达明显降低［14］。此外，Demendi等［15］发现，11β－羟基类固醇脱氢酶 2(11β－hydroxysteroid dehydrogenase type 2，11βHSD2)也是胎盘屏障的一个重要组成成分，其主要功能是在母体血糖升高时保护胎儿免受高糖损伤。

2 药物胎盘转运的体外研究方法及应用

2.1 胎盘小叶灌流

2.1.1 胎盘小叶灌流方法

体外人体胎盘灌流是20世纪60年代发展起来的一项技术，其原理为采用刚分娩出的人体胎盘，模拟体内条件确保胎盘的生物活性，建立体外母体循环和胎儿循环，在母体侧灌流液中加入一定浓度的待测药物或化学物，平衡一段时间后，通过检测胎儿侧灌流液中待测物浓度确定其胎盘透过性。但由于整体胎盘灌流成功率极低，70年代被简化为胎盘小叶灌流，是目前唯一在器官水平研究胎盘屏障功能的模型，近期的一项分析显示该模型与体内药物转运具有很好的相关性，能用于预测体内胎盘药物转运情况，使用蛋白结合和血液pH调节该模型检测结果可使其对体内情况的预测更精确［16］。

2.1.2 胎盘小叶灌流模型特点

虽然该模型能很好地模拟体内药物胎盘透过情况，但由于其操作难度较高，成功率低，且胎盘小叶体外存活时间有限，难以用于大规模的药物筛选。试验期间需确保胎盘具有生物活性也增加了该模型的应用难度，常用的活性监测方法包括葡萄糖消耗量、氧消耗、pH值、乳酸生成量和胎盘激素的分泌以及组织形态变化等。该模型的具体细节如胎儿和母体循环的建立方法、灌流速度、灌流液总量、含氧混合气体组成等各实验室均不完全一致。

模型建立是否成功的评价亦无统一标准，一般认为胎儿循环灌流液损失量越小越好，可以接受的渗漏丢失量范围为2～3 ml［17］;评价离体小叶灌流模型的另一方法为选用一种或几种对胎盘具有稳定透过性的药物从母体侧灌流，通过计算该物质的胎盘透过率评价该模型是否成功，最常用的标记物为解热镇痛药安替比林，也有试验选用葡萄糖、菊糖、肌酐等。

2.1.3 胎盘小叶灌流模型应用

胎盘小叶灌流模型已被广泛用于足月及不足月胎的药物透过情况评估。有研究使用该模型比较了足月胎盘(38～41周)和不足月胎盘(27～34周)对P－gp底物美沙酮的通透性，结果显示足月胎盘对美沙酮的通透性较不足月胎盘高30%［18］。这与先前的研究结果P－gp在胎盘的发育过程中表达量逐渐降低相一致。

近期的一项研究使用该模型评估了抗病毒药物磷酸奥司他韦的体内活性代谢物——奥司他韦羧酸盐的胎盘透过性能，用 H－3 同位素标记的奥司他韦羧酸盐350 μg·L－1和14C同位素标记的安替比林20 mg·L－1的灌流液从母体侧灌入，高效液相色谱法检测母体侧、胎盘组织及胎儿侧灌流液中原型药物及其所有代谢产物，灌流4 h后，约21%的药物进入胎儿循环;13%的药物滞留于胎盘小叶;66%留在母体侧灌流液中，其胎盘透过率为安替比林的47%，证实奥司他韦羧酸盐存在胚胎暴露［19］。同样，Nanovskaya 等［20］用类似的方法证实万古霉素及特拉万星(telavancin)存在低胎盘透过率。

此外，胎盘小叶体外灌流还可用于研究个体间药物透过差异的原因，Tertti等［21］近期的研究显示，可溶性物质载体(solut carrier，SLC)家族的SLCO1B3的基因多态性可能影响口服降糖药瑞格列奈的胎盘转运，遗憾的是，由于该实验样本量较小，未达统计学差异。

2.2 人胎盘传代细胞系

2.2.1 人胎盘常用传代细胞系及其特点

毒理学研究常用的人胎盘细胞株有3种:BeWo，JAR和JEG－3，均来源于绒毛膜癌细胞，均表达于人体胎盘相似的异物代谢酶，如CYP1A1，CYP19等［22］，均可用于研究胎盘激素分泌、胎盘细胞对外源性异物的摄取、外排以及代谢。BeWo，JAR和JEG－3也可用于研究胎盘的药物转运，但值得注意的是，鉴于传代细胞系的来源及永生化处理，其转运蛋白表达与原代滋养细胞不完全一致:BeWo，JAR和JEG－3细胞株的P－gp表达均比从足月胎盘分离的原代滋养细胞低得多，有的甚至低于检测限［23］;而对于 BCRP，BeWo 和JAR的表达与人体胎盘相似，JEG－3较低;BeWo和JAR细胞的ABCC2较原代滋养细胞高而ABCC1较原代滋养细胞低。BeWo细胞保留了许多人滋养细胞的形态学特征［24］，其形态类似含有少量合胞体细胞的未分化滋养细胞。与BeWo细胞株不同，JEG－3细胞更多地保存了合体滋养层细胞的生理和生化特征［25］。

2.2.2 传代细胞的研究应用

细胞水平研究胎盘屏障功能的常用细胞株为BeWo b30，它能在Transwell培养板上长成紧密极化的单层细胞。一般认为此模型与体内胎盘屏障真实情况有一定的差距，有趣的是，对多种底物药物的研究发现该模型与胎盘小叶灌注模型结论高度一致，后又有研究者使用该模型研究了安替比林、草甘膦、苯甲酸、咖啡因等4种药物的胎盘透过性，经验证发现其与体内情况也能很好地吻合［26］。

值得注意的是，以上涉及的药物均不是外排性转运蛋白P－gp底物，鉴于细胞系胎盘屏障模型上P－gp表达显著低于生理情况，用其预测P－gp底物的体内胎盘透过率可能欠妥。尽管在所有BeWo细胞克隆中，b30克隆株的P－gp表达最高，其与生理情况下胎盘的P－gp表达量仍存在较大差距。因此，有研究者尝试用载有ABCB1基因的病毒载体转染BeWo细胞，定量PCR检测显示转染细胞P－gp的表达量可达常用BeWo细胞的10倍左右，有研究者进一步使用该转染模型验证了P－gp介入了糖皮质激素的胎盘屏障［27］。理论上使用过表达P－gp且能形成单层紧密连接的传代细胞系能较好地模拟胎盘屏障用于研究P－gp底物药物的胎盘转运，但目前相关报道仍较少，有待更多的研究对该模型加以验证。

另外，一些研究考察了该模型对非药物的有害物质的屏障作用:Nielsen等［28］使用该模型检验了一种致癌性物质脱氧雪腐镰刀菌烯醇的胎盘透过能力，发现该物质的胎盘转运存在延迟现象，而这一结论也被体外胎盘灌流模型证实;最近的一项通过该模型和胎盘小叶灌流模型考察赭曲霉毒素A胎盘透过能力的研究也证实，两模型得出的结论一致——仅少量(约3%)的赭曲霉毒素A能透过胎盘［29］。

近期的研究还发现，JEG－3和BeWo b24也有长成单层极化紧密连接的潜力，经过适当的条件优化有望成为体外研究胎盘药物转运的模型［30－31］。

2.3 原代细胞

原代的人胎盘绒毛滋养细胞也可被分离、消化、纯化，但过程较复杂［32］，一般一次分离较多的细胞，冻藏后分次取用。显然，相对于癌细胞株，原代细胞能更真实地展现正常胎盘组织的生理生化特点。遗憾的是，原代胎盘细胞不能增殖，无法形成紧密连接的单层细胞，也就不能用于体外模拟胎盘屏障。另外，原代细胞在体外培养一段时间后，其转运蛋白的表达可能会发生变化。Evseenko等［23］报道，体外培养120 h后，从足月胎盘分离的滋养细胞中P－gp明显降低，而BCRP却升高。这些特点限制了原代细胞在药物胎盘转运研究中的应用。

2.4 胎盘外植体及绒毛组织

人体胎盘外植体及绒毛组织培养广泛用于研究胎盘的转运体、代谢酶表达以及内分泌功能。因绒毛组织块内尚含有大量的间充质干细胞(成纤维细胞、肌成纤维细胞和平滑肌细胞等)，近期也用于研究胎盘的增殖、分化［32］，还用于研究增殖和分化相关信号通路及其影响因素［33］。同样，外植体及绒毛组织因不是完整的半透膜不能用于评价药物的胎盘透过性。且与原代细胞不同的是，用于培养的胎盘组织必须是新鲜的，不能冻融，这更加增加了其实际应用的难度。

分离疾病状况下胎盘组织检测某些成分如转运蛋白的表达或功能变化既可用于其病理生理学研究，在一定程度上也可以为该疾病的诊断提供新思路。例如，最近的一项研究发现羊水过少的足月胎盘上水通道蛋白8和水通道蛋白9的表达明显低于羊水正常的胎盘，这两种蛋白在羊水的形成和转运中均起到非常重要的作用，可能能通过上调其表达来治疗羊水过少［34］。

2.5 细胞亚结构研究

使用不同的离心方法可分离滋养细胞的亚成分，如微粒体和细胞质等用于研究代谢酶对外源性异物的代谢能力［35］。刷状缘和基膜上的另一亚结构—膜囊泡因天然表达某些转运蛋白也被分离用于研究基本转运机制，也可在分离的膜囊泡上过表达某些转运体来研究其对底物的转运特点［36］。近期的一项研究即利用足月胎盘微绒毛浆膜中分离出来的囊泡研究甲状腺素激素的母体－胎儿转运，发现母体的T(3)和T(4)主要通过MCT8和MCT10转运进入胎儿循环［1］。

3 展望

人体胎盘因分娩后易获得而广泛用于体外研究，目前已建立多种体外研究胎盘功能的方法及试验模型。在众多的方法中，只有胎盘小叶灌流模型及能长成单层紧密连接的细胞模型可用于研究药物或其他化合物胎盘屏障透过能力，而原代滋养体细胞分离培养、胎盘组织块分离、细胞亚结构分离以及其他的癌源性细胞株只可用于转运体及代谢酶的功能或表达、胎盘的增殖分化及内分泌功能等研究。最近的研究表明，体外胎盘小叶灌流模型能很好地预测体内药物胎盘药物透过率，但其建模困难和存活时间短(2～6 h)不适于大规模检测药物的胎盘屏障透过率。用永生细胞株建立的胎盘屏障细胞模型可用于大量药物的透过性检测，且近期的研究也证实，对于多种药物的转运，该模型与小叶灌流模型或体内药物透过情况存在较好的一致性，然而，检测所用的药物种类有限，且尚未涉及 P－gp等转运体的底物药物，而BeWo 30b和JEG－3等细胞株上转运体的表达与原代滋养体细胞存在较大差异，该模型能在多大范围内预测体内药物胎盘透过情况有待进一步探讨。

总的来说，目前已有多种体外研究胎盘功能的试验模型，但尚无一种方法能有效地对药物的胎盘透过能力进行常规筛查，有待建立更完善的体外方法来预测药物体内胎盘屏障透过情况。对现有模型进行优化，使其在符合研究要求的同时更接近生理状况可能为一个可行的策略，如转染传代细胞系使其过表达外排转运体用于评价其底物药物的胎盘透过情况。研究药物的胎盘转运机制对解析药物有效性、安全性和毒性具有重要意义，尽管目前该领域的研究尚欠缺系统性，研究模型也存在各自的局限性，随着分子生物学、基因工程等现代医药卫生学的不断发展，研究模型的创新和优化将为该领域的发展带来广阔的前景。

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