血栓通粉针（三七总皂苷）对大鼠脑缺血再灌注损伤后Bcl-2 蛋白表达的影响

蒋媛静

（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530001）

脑缺血再灌注后脑损伤的发生可能与缺血再灌注后神经细胞生存环境发生变化，包括兴奋性氨基酸、自由基、一氧化氮（NO）、Ca2+等，以及一些诱导凋亡的基因过度表达有关。Bcl-2 基因是第一个确认为能对抗细胞凋亡的基因［1-2］。本实验旨在通过观察血栓通粉针对脑缺血大鼠神经元凋亡相关基因Bcl-2 蛋白表达的影响，对脑缺血再灌注损伤与Bcl-2 蛋白的关系进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康Wistar 大鼠60 只，雌雄不分，体质量240～320 g（由广西中医药研究所提供）。将60只大鼠随机分成血栓通大剂量组（A 组）、血栓通小剂量组（B 组）、川芎嗪组（C 组）、模型组（D 组）、假手术组（E 组）5 组，每组12 只。造模前12 h 禁食。

1.2 药品与试剂 Bcl-2 抗体、Bcl-2 免疫组织化学试剂盒，DAB 显色试剂盒由北京中山生物技术研究所购，为Sigma 公司产品。血栓通粉针剂的主要成分为三七总皂苷，由广西梧州制药集团有限公司提供。川芎嗪注射液，由四川蜀乐药业股份有限公司提供。

1.3 造模与给药 A、B 组术前3 d 腹腔注射血栓通粉针，分别按10、5 mg/kg 剂量给药。C 组术前3 d 腹腔注射川芎嗪注射液，按80 mg/kg 标准给药，每日1次。D、E 组术前3 d 给予腹腔注射生理盐水，每次2 mL。采用改良Longa 线栓法［4］制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型。大鼠水合氯醛麻醉后颈部正中做切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉，在颈总动脉结扎远端剪一小口，将制备好的5 cm 头端浸蜡鱼线沿颈总动脉插入至颈内动脉，头端距颈外动脉分叉口约2 cm 鱼线另一端暴露于缝合后的切口外并做标记，2 h 后拔出鱼线2 cm，大鼠清醒后行Longa 5 分制神经功能评分，1～3 分者入选。剔除造模后烦躁、剧烈跳动及经解剖证实为蛛网膜下腔出血的大鼠。E 组大鼠仅给予剥离颈内动脉，不结扎血管；其余4 组大鼠建立大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型，各组于术前30 min 各给药1次，术后6 h 再给药1次。

1.4 标本采集与检测

1.4.1 脑组织切片的制作 各组动物于手术后24 h取材。4%多聚甲醛心脏灌注固定、取脑备用。在4℃冰箱保存经4%多聚甲醛固定6～8 h，然后经10%及20%蔗糖梯度脱水后，将固定的标本用恒冷冰冻切片机将视交叉层面切成4 μm 厚的冠状切片，贴附于涂有APES 胶的载玻片上。

1.4.2 免疫组化染色（SABC 法）脑组织经冰冻切片，封闭内源性过氧化物酶，羊血清处理后，加入抗Bcl-2 单抗，4℃过夜，依次滴加生物素化山羊抗小鼠IgG 及试剂SABC 20～37℃20 min，DAB 显色后常规复染、脱水、透明、封片、观察。光学显微镜选择大鼠两侧海马CA1段的神经元，以细胞质内出现鲜艳的棕黄色颗粒为阳性细胞，每张切片高倍镜下5个不同的视野，计数每个视野内的阳性细胞占全部神经元的百分率，取平均值。用Image Pro Plus 图像分析仪测量Bcl-2 蛋白表达的平均光密度值表示Bcl-2 蛋白染色强度。

1.4.3 HE 染色 冰冻切片，Harris 苏木素液5 min，75%盐酸乙醇分化30 s，酸化伊红乙醇1～2 min，脱水、透明、中性树胶封片。

1.5 统计学处理 应用SPSS11.5 统计软件。计量资料以表示，采用t 检验，方差齐性分析用F 检验；组间比较用q 检验和t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 Bcl-2 免疫组化染色阳性细胞胞浆染成棕黄色，核染色较浅，多为胶质细胞，可见突起，神经元亦可见到胞浆或在核周染成棕黄色。E 组大鼠脑组织海马区未见Bcl-2 阳性细胞表达，A 组和C 组海马区可见Bcl-2 阳性细胞表达染色较深。D 组血栓通小剂量组见少量Bcl-2 表达。

2.2 Bcl-2 蛋白表达情况 见表1。缺血再灌注24 h后，D 组大鼠与E 组比较Bcl-2 蛋白阳性细胞数目增多（P＜0.05）；与D 组比较，A 组、C 组大鼠Bcl-2 蛋白阳性细胞数目明显增多（P＜0.01）。与B 组比较，A 组Bcl-2 阳性细胞增高有显著性（P＜0.05）。A 组与C 组比较未见明显差异（P＞0.05）。D 组海马CA1段Bcl-2蛋白表达光密度值显著高于E 组，表明Bcl-2 蛋白表达量显著高于E 组（P＜0.05）；与B 组比较，A 组光密度值增高（P＜0.05）。A 组、C 组海马CA1段Bcl-2 蛋白表达光密度值高于B 组（P＜0.01），A 组与C 组之间比较无明显差异（P＞0.05）。

表1 各组缺血再灌注24 h 大脑海马区Bcl-2 蛋白表达率和表达光密度值（±s）

表1 各组缺血再灌注24 h 大脑海马区Bcl-2 蛋白表达率和表达光密度值（±s）

与D 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。与B 组比较，▲P＜0.05；与E组比较，#P＜0.01。

2.3 组织形态学改变 HE 染色，光镜下所见×40：E组大脑海马各区，未明显特殊病变，神经细胞未见体积增大、水肿变性、坏死改变。D 组大脑海马各区，尤其是CA1区，见神经细胞肿胀，体积增大，胞浆淡染、疏松，核膜不清、碎裂、溶解，细胞数目减少。A 组神经细胞接近正常，胞浆稍疏松、淡染，体积稍大，未见神经坏死。B 组神经细胞尚肿胀，体积增大，胞浆淡染，但未见明显坏死。C 组神经细胞稍肿胀，胞浆淡染，未见明显神经细胞坏死。

3 讨论

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡（PCD），其具有生理性和选择性特征机体内环境发生改变，在各种信号刺激下，细胞通过不同的信息途径导致其正常代谢方式关闭，启动细胞凋亡代谢途径，并在严格的基因控制下合成所需的特定蛋自酶［5］，激活内源性DNA 内切酶完成细胞自杀过程。研究表明，一些凋亡抑制剂如YVAD-FMK、zDEVD、FMK、zVAD.FMK、CrmA、凋亡抑制蛋白、Bcl-2 家族均可抑制细胞凋亡，缩小梗死体积，改善脑水肿，延长治疗时间窗。神经生长因子的抗凋亡作用也已被确认。其中Bcl-2 基因是第一个确认为能对抗细胞凋亡的基因［1-2］。

本实验结果表明，缺血30 min 再灌注24 h时存活脑细胞中有大量Bcl-2 表达，表达主要位于缺血周边区，缺血中心区为坏死细胞。可以认为，脑缺血再灌注能促使Bcl-2 表达，Bcl-2 蛋白参与脑缺血的自我保护过程。假手术组Bcl-2 散在微弱表达，推测是由于手术创伤刺激引起。血栓通大剂量组海马区Bcl-2 表达高于缺血再灌注组的结果，表明大剂量血栓通能减少神经元的死亡，可保护Bcl-2 蛋白表达，抑制海马神经元的凋亡。

血栓通粉针（三七总皂苷）除了促使Bcl-2 大量表达从而保护神经细胞外，还可能通过以下机制保护神经元。（1）钙通道阻断作用：降低缺血脑组织的总钙含量，减轻缺血缺氧时脑细胞内Ca2+过负荷［6］。（2）抑制NO 含量：脑缺血再灌注期大量产生的NO 对神经细胞具有毒性作用，高浓度的NO 可抑制线粒体呼吸链，使能量衰竭；可介导其他毒性自由基的产生，引起膜损伤；抑制DNA的合成和修复及诱导细胞凋亡网。三七总皂苷可使脑组织NO 含量降低，而对NOS 活性无显著影响。表明其抗脑缺血作用与其抑制NO的释放，减轻NO的神经毒性有关［7］。（3）抗自由基作用：能使血中超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，而丙二醛（MDA）显著减少，PNS 可以有效地保护内源性SOD 活性，抑制脂质过氧化反应，具有明显的抗氧自由基作用［8］。（4）减轻脑水肿，改善血脑屏障通透性［9］。（5）降低兴奋性氨基酸的毒性作用［10］。（6）能显著降低TC，TG，LDLCH、全血黏度、血浆黏度、血细胞比容的作用，具有抑制大鼠血栓形成、抗缺血性脑损伤作用［11］。

本实验表明，脑缺血时血栓通粉针（三七总皂苷）能显著上调体内Bcl-2 表达，减轻缺血再灌注后神经细胞损伤，有望作为一种有效的神经保护剂应用于脑缺血疾病的治疗。

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