两种γ-干扰素释放试验检测结核菌感染的对比研究

朱桂云 杨永辉 安晓颖 康丽菲 陈宁 欧阳琴

我国是结核病高发国家之一，每年新增结核病患者约150万。在结核病防治中，我们面临的最大难题之一就是如何快速准确地诊断结核。γ-干扰素释放试验是一种新的诊断结核的辅助手段，因其具有较高的敏感性和特异性，已受到临床越来越广泛的重视［1］。目前有两种较为成熟的γ-干扰素释放试验方法，即酶联免疫吸附法(ELISA)和酶联免疫斑点法(ELISPOT)［2，3］，本研究选用分别采用这两种方法的结核杆菌特异性细胞免疫反应(A.TB)试剂盒和结核感染T 细胞斑点试验(TSPOT.TB)试剂盒进行γ-干扰素释放试验，对比研究检测结果的一致性，探讨二者的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料随机选取2012 年1 至6 月初次在我院住院的临床诊断为肺结核和待排除肺结核的患者70 例，其中男38例，女32 例;年龄22 ～53 岁，平均年龄37.6 岁。70 例患者中有44 例确诊为肺结核(以痰涂片发现抗酸杆菌或结核分枝杆菌培养阳性为标准)，剩余的26 例均为排除肺结核的诊断，其中普通细菌感染引起的肺炎19 例，肺癌4 例，间质性肺炎2例，结节病1 例。

1.2 仪器与试剂CO2培养箱，水浴锅，酶标仪。T-SPOT.TB试剂盒(英国Oxford Immunotec Ltd 生产)，A.TB 试剂盒(海口维瑅瑷生物研究院生产)，RPMI1640 培养液，PBS 缓冲液，AIMV 培养液，淋巴细胞分离液。

1.3 方法

1.3.1 T-SPOT.TB 检测:①外周血单个核细胞的分离、收集与计数:每个入选病例采集4 ml 外周血标本置于肝素锂抗凝的试管中，立即混匀，在4 h 内进行PMBC 分离。即加入等体积的RPMI1640 培养液混匀后缓慢加在4 ml 淋巴细胞分离液上层，2 500 r/min水平离心22 min 后吸取中间层云雾状细胞(PMBC)。在PMBC 中加入RPMI 1640 至10 ml，1 900 r/min 水平离心7 min，弃去上清液。加入 AIM-V 培养液至10 ml，1 700 r/min水平离心7 min，弃去上清液。进行显微镜下细胞计数，根据计数结果用AIM-V 调节剩余细胞悬液浓度至2.5×106/ml。②体外抗原刺激与孵育:取出试剂盒中的微孔板，1 份标本需4 个孔，分别加入阴性对照AIM-V、抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)、阳性对照植物凝集素PHA 各50 μl，然后在每孔中加入细胞悬液各100 μl，置于37℃，5%CO2培养箱中培养16 ～20 h 后用PBS 缓冲液洗板4 次，加入新鲜稀释的酶标记单抗50 μl，2 ～8℃孵育1 h 后再用PBS 缓冲液洗板4 次，每孔加入显色底物50 μl，避光室温静置7 min 后用蒸馏水冲洗观察结果，用显微镜计数每个孔中的斑点。③结果判定:阴性对照孔斑点数为0 ～5 个，抗原A 和抗原B 检测孔任一孔计数－阴性孔计数≥6 判为阳性;如果阴性对照孔斑点数≥6，检测孔斑点数≥2 倍阴性孔斑点数判为阳性。

1.3.2 A.TB 检测:①全血刺激:每个入选病例采集3 ml 外周血标本置于肝素锂抗凝的试管中，立即混匀，16 h 内进行刺激。刺激时每个病例需取3 个无抗凝剂采血管做为反应管，阴阳性对照管分别加入阴性刺激剂20 μl、阳性刺激剂20 μl，测试管加入刺激剂1(ESAT-6)10 μl 和刺激剂2(CFP-10)10 μl;之后每个采血管中各加入1 ml 充分混匀的全血，盖紧盖子剧烈晃动直至有泡沫出现，然后立即直立向上置于37℃的水浴箱中孵育22 ～24 h。②制备标准曲线及进行γ-干扰素检测:按说明配制6 个不同浓度的标准品，浓度为0.156 ～5 U/ml。加样:取出试剂盒中的酶标板，取6 种不同浓度的标准品及样品稀释液各100 μl 以复孔形式加入酶标板孔中;每个样品检测孔中加入样品稀释液及待测样品各50 μl;置37℃水浴箱中孵育1 h。用配好的洗涤液洗板5 次，拍干后每孔加入100 μl配好的检测抗体工作液，置37℃水浴箱中孵育30 min。再用洗涤液洗板5 次，拍干后每孔加入100 μl 亲和素-辣根过氧化物酶工作液，置37℃水浴箱中避光孵育30 min。用洗涤液洗板5 次后加入酶作用底物100 μl(底物A 与底物B 各50 μl 充分混匀)，37℃水浴箱中避光孵育10 min，然后每孔加入100 μl 终止液，5 min 内用酶标仪读取450 nm 处的OD 值。③标准曲线的绘制及及结果判定:应用Microsoft office Excel 软件，以标准曲线各点浓度的自然对数(LN)作为横坐标X，OD 均值的自然对数作为纵坐标Y，做XY 散点图，添加趋势线，得到标准曲线方程Y=aX+b及其线性相关系数R2。分别取样品的N(阴性对照)、T(检测)OD 值的自然对数Y、P(阳性对照)值，然后将其代入上述标准曲线方程求得各自对应的X 值，再分别求反对数后乘以稀释倍数2，得到N、P 和T 三个浓度值，最后以P 值和T 值分别减去N 值，得到(P－N)和(T－N)值。当N ＜0.5 U/ml 时，(TN)/(P－N)≥0.60 时判为阳性，否则为阴性;当N≥0.5 U/ml时，(T－N)/(P－N)≥0.85 时判为阳性，否则为阴性。

1.4 统计学分析 将两种方法测出的结果进行比较，分析其一致性用McNemar 检验，一致性强度采用κ 系数表示，κ ＞0.4表示两者一致性较好，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

44 例结核病患者A.TB 检测为阳性的有40 例，敏感性90.9%;T-SPOT.TB 检测为阳性的有41 例，敏感性93.2%。26例非结核病患者A.TB 检测阴性的为23 例，特异性为88.5%，T-SPOT.TB 检测阳性的为24 例，特异性为92.3%。两种检测方法相比较，差异无统计学意义(P=1.000)，检测一致性也较强(κ=0.819)，两者的敏感性也较一致(P =1.000，κ=0.535)，但T-SPOT.TB 的特异性稍强于A.TB(P=1.000，κ=0.339)。见表1。

表1 A.TB 与T-SPOT.TB 两试验方法诊断效能一致性分析

3 讨论

结核病的早期快速诊断已经成为制约结核病控制的关键因素。目前，常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60%。为克服传统痰涂片、痰培养及结核菌素试验等检测方法的不足，近年来发展的以T 细胞免疫应答为基础的γ-干扰素释放试验，采用ELISA 或ELISPOT(酶联免疫吸附/酶联免疫斑点)方法定量检测全血/外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放γ-干扰素的水平，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染以及结核病，比结核菌素试验有更高的敏感性与特异性［4］。其原理是机体受到结核分枝杆菌感染后产生的记忆性T 细胞，在再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激时会释放γ 干扰素，可以在体外对释放的γ 干扰素水平或能有效释放γ 干扰素的T 细胞进行定量，从而判断机体是否结核分枝杆菌的感染者。目前有两种较为成熟的γ-干扰素释放分析技术，即QFT-G 试验(cellestis incorporated，carnegie，Australia)和T-SPOT.TB 试验(Oxford Immunotec，Abingdon，UK)。其对应的方法和试剂盒先后被美国FDA 批准应用于临床，CDC 为其指定了使用指南。本研究所采用的A.TB 试剂盒是以QFT-G 试验为基础发展而来的，是利用酶联免疫法检测分泌的γ 干扰素的量;而T-SPOT.TB试剂盒是利用酶联免疫斑点法检测分泌γ 干扰素的淋巴细胞数量。以往的研究中，采用的都是进口的T-SPOT.TB 试剂盒，A.TB 试剂盒做为新研制出来的一种国产试剂盒，目前在国内的应用较少，本研究将两种试剂盒做对比研究，发现其检测效能具有较高的一致性(P ＞0.05，κ ＞0.4)，表明A.TB 试剂盒和T-SPOT.TB 试剂盒一样，也可以作为临床上诊断结核比较可靠的一种辅助手段。

本研究中T-SPOT.TB 试剂盒的检测敏感性为93.2%，特异性为92.3%，这与前人的研究相符，也证实T-SPOT.TB 的确可以作为辅助检测结核菌感染的有效手段。通过对比检测结果，我们发现A.TB 试剂盒的敏感性和特异性也很高，这可能与A.TB 采用新的方法制作刺激抗原有关。γ-干扰素释放试验试剂盒中最关键的部分是ESAT-6 和CFP-10 抗原，目前QFT-G和T-SPOT.TB 的试剂盒主要以这两种抗原为基础［5］。ESAT-6和CFP-10 的蛋白编码来源于结核分枝杆菌基因中的一个菌种特异性基因片断，称为region of difference l(RDI)。这个基因片断不存在于大部分的非结核分枝杆菌以及所有的牛型分枝杆菌(包括卡介苗)中，因此ESAT-6 和CFP-10 作为抗原具有较高的特异性。虽然A.TB 试剂盒和T-SPOT.TB 试剂盒都采用ESAT-6 和CFP-10 作为刺激抗原，但具体的组成却有很大的差异。A.TB 在制作刺激抗原时使用了一种新的抗原投递系统作为分子注射器，用的是经修饰的基因工程组ESAT-6 及CFP-10 全长蛋白，T-SPOT.TB 采用的刺激抗原是ESAT-6 和CFP-10 的肽段组合。全长的ESAT-6 和CFP-10 抗原可以最大限度地递呈抗原中的影藏表位和不同免疫优势的表位，激活更广泛的T 细胞进行响应，同时又具有抗原质量稳定的优势。这在很大程度上提高了A.TB 试剂盒的特异性和敏感性。

除了检测效能一致外，两个试剂盒各有特点，T-SPOT.TB试剂盒在国内的研究及应用较多，方法成熟，结果判读直观，但成本较高，需提取淋巴细胞并培养，培养前操作步骤较多，较易受到污染，比较适合实验室条件好，医疗条件高的大型医院;A.TB 试剂盒成本较低，用血量少，加入刺激剂后直接全血孵育，操作简单不易污染，又节省了培养液，但操作过程稍复杂，需要做标准曲线进行质控，较适合基层医院和大规模普查。此外T-SPOT.TB试剂盒还有用于胸腹水、肺泡灌洗液中结核杆菌感染检测的报导，但A.TB 试剂盒目前还只能用于检测全血样本。

综上，每个实验室可以根据自己的实际情况选择其中一种方法为临床提供及时可靠的检测报告。

1 Meier T，Eulenbruch HP，Wrighton-Smith P，et al.Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay(T SPOT-TB)for diagnosis of tuberculosis in clinical practice.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2005，24:529-536.

2 Mazurek GH，Jereb J，Lobue P，et al.Guidelines for using the QuantiFERON-TB Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection，United States.MMWR Recomm Rep，2005，54:49-55.

3 Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century:new tools to tackle an old enemy.Chest，2007，131:1898-1906.

4 吴妹英，王霞芳，肖玉梅，等.酶联免疫斑点法在快速诊断活动性肺结核中的应用.中华实验和临床感染病杂志，2009，5:1-4.

5 Madhukar P，Lee WR，John M，et al.Interferon-γassays in the immunodiagnosis of tuberculosis:a systematic review.Infectious Diseases，2004，4:761-773.