白僵菌对不同生境淡色库蚊的致病力研究*

刘丽娟 寇景轩 田宝振 王海防 程 鹏 崔 勇 公茂庆

(山东省医学科学院，山东省寄生虫病防治研究所，山东济宁 272033)

球孢白僵菌属于半知菌亚门Deuteromycotina，白僵菌属Beauveria，是一种常规的生物杀虫剂，具有高效、对非靶标生物较安全、容易大量生产以及防治成本低廉等特点(Genthneretal.，1992；韩宝瑜等，1996；)，而且与部分低毒杀虫剂具有较好的相容性(Hancock，2009；Howardetal.，2010；蔡悦等，2011；熊琦等，2012)，可以与化学杀虫剂混用，共同防治害虫。球孢白僵菌在农、林业害虫的防治中已广泛应用(Teferaetal.，2003；Rassetteetal.，2011；邓春生等，2012)，尤其对玉米螟和松毛虫的生物防治，在国内已作为常规手段连年使用。目前研究发现球孢白僵菌对蚊虫具有致病性，尤其对传疟蚊虫的致病性研究已有较多报道(Achonduhetal.，2008；De Paulaetal.，2008；Mnyoneetal.，2012)，对淡色库蚊Culexpipienspallens致病性的研究较少。淡色库蚊属于尖音库蚊的亚种，可传播班氏丝虫病及流行性脑炎等蚊媒传染病，是重要的传播媒介，目前已对多种化学杀虫剂产生不同程度的抗药性(王新国等，2003；Huangetal.，2003)，因此真菌对淡色库蚊致病性的研究意义重大。受生境微气候的影响，蚊虫对真菌杀虫剂也可能表现出不同程度的敏感性，因此，我们采集5个不同点的淡色库蚊幼虫用于试验，以期初步研究白僵菌对不同生境蚊虫的致病力，为蚊虫的生物防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试菌株：试验用球孢白僵菌Beauveriabassiana从鳞翅目僵虫上分离获得，现保存于山东省寄生虫病防治研究所。利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)斜面4℃保存菌株，试验时将菌株转接到PDA平板上进行培养，收集孢子待用。

1.1.2供试虫源：试验用蚊虫分为A、B、C、D和E 5组，A组蚊虫从济宁市唐口镇医院污水中采集，B组蚊虫从济宁市郊区养猪场废水沟采集，C组蚊虫从微山湖稻区排水沟中采集，D组蚊虫从山东省寄生虫病防治研究所院内水缸中采集，E组为室内饲养蚊虫。野外采集到的蚊虫鉴定蚊种和龄期后直接用于试验。室内蚊虫饲养条件：温度28℃，相对湿度为70%～80%，光周期为光照:黑暗=12L:12D，幼虫用猪肝粉和酵母粉的混合饲料喂养。试验均用淡色库蚊2龄幼虫。

1.1.3培养基：PDA培养基：马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。配置好的培养基经高温高压灭菌(121℃，30 min)。

1.2 方法

1.2.1孢子悬浮液的配制：试验时将供试菌株转接到PDA平板上，在25℃培养箱中培养1周，待菌落长满PDA平板，用0.03%的吐温80无菌水洗脱，磁力搅拌器搅拌30 min，后用双层纱布过滤，血球计数板测量母液浓度。孢子悬浮液浓度稀释成1×106孢子/mL，待用。

1.2.2球孢白僵菌对不同栖境淡色库蚊幼虫的致病力：试验容器为一次性透明塑料饮水杯，每杯盛有浓度为1×106孢子/mL的孢子悬浮液100 mL，淡色库蚊2龄幼虫25条。将5个点蚊虫设成5个处理，另设不加孢子悬浮液的空白对照，每个处理设4个重复，每天加一次饲料。试验温度25℃，光周期为光照∶黑暗=12L∶12D。连续观察10 d，逐日统计感染死亡虫数，计算试验10 d后淡色库蚊的累计死亡率。

1.2.3统计分析： 所有试验数据采用统计分析软件SAS9.1处理，图由Excel处理系统完成。

2 结果

球孢白僵菌对不同生境淡色库蚊幼虫均有较好的致病力，幼虫死亡率与菌株处理时间的关系见图1。各组对照组蚊虫在试验期内未有死亡，试验期间已羽化为成蚊，因此在图中未标出。从图中可以看出，经孢子悬浮液处理后，各组淡色库蚊幼虫的累计死亡率均随时间的延长而逐渐增加，室内饲养蚊虫的死亡率曲线较平滑，在试验的3～6 d幼虫大量死亡；而野外采集蚊虫的死亡率曲线不规整，在试验开始后的第5～8 d，幼虫大量死亡。试验10 d后，各组蚊虫累计死亡率均达95%以上，存活下来的蚊虫生长缓慢，生活史明显延长。经孢子悬浮液处理后，五组蚊虫的致死中时LT50见表1，从表中可以看出，室内饲养蚊虫的致死中时LT50最短，仅3.8 d，野外采集蚊虫的致死中时在6 d左右，其中从养猪场废水沟中采集的蚊虫致死中时最长，为6.4 d。唐口镇医院污水、济宁郊区养猪场废水中采集蚊虫与其他生境中蚊虫的致死中时LT50差异显著，稻区排水沟、院内水缸中蚊虫与室内饲养蚊虫的致死中时LT50差异显著，其余各组间差异不显著(F=67，P=0.001)。

图1 球孢白僵菌处理后不同栖境淡色库蚊幼虫的累计死亡率Fig.1 The accumulated mortality of Cx. pipiens pallens from different habitats by the strain of B. bassianaA：从济宁市唐口镇医院污水中采集的蚊虫；B：从济宁市郊区养猪场废水沟中采集的蚊虫；C：从微山湖稻区排水沟中采集的蚊虫；D：从山东省寄生虫病防治研究所院内水缸中采集的蚊虫；E：室内饲养蚊虫。下同。A: Mosquitoes were collected from sewage at TangKou Town hospital；B: Mosquitoes were collected from Piggery waste water at the outskirts of Jining City；C: Mosquitoes were collected from drainage ditch of paddy field in Weishan Lake；D: Mosquitoes were collected from water vat in Shandong Institute of Parasitic Diseases；E: Mosquitoes were breeding in the laboratory.The same below.

处理组Treatment groupLT-P回归式LT-P regressionLT50/dRAy=12.352x-25.5336.2 a0.9761By=13.055x-30.46.4 a0.9591Cy=13.339x-28.6675.7 b0.9722Dy=13.121x-21.1675.8 b0.9794Ey=12.248x-1.46673.8 c0.9323

LT50一列中，相同字母在0.05水平上差异不显著(LSD法).

The same letter on the medium lethal times indicates no significant difference atP=0.05 level (LSD).

3 讨论

球孢白僵菌作为生物防治的常规菌种之一，在农、林业害虫的防治中发挥了重要的作用，但其作用效果受多种因素的影响，有研究报道害虫种类以及不同的接种方式均会影响致病菌的作用效果(蔡守平等，2009；刘丽娟等，2011；Bukharietal.，2010)。蚊虫的孳生环境复杂，水体中的微生物种类多，生境内的微生物可能影响白僵菌的作用效果，因此，本文利用从自然界中分离筛选出来的高致病力菌株，研究其对不同生境蚊虫的致病力。结果发现球孢白僵菌对不同生境蚊虫均具有较高的致病力，但野外组蚊虫的致死中时LT50明显大于室内饲养蚊虫，究其原因，一方面可能因为野外蚊虫在自然界中遵循优胜劣汰的自然法则，存活下来的蚊虫应对不良环境的能力更强；另一方面野外蚊虫体内可能存在某些微生物，对白僵菌具有一定程度的抑制作用，有报道称德国小蠊Blattellagermanica肠道菌对白僵菌具有明显的抑制作用(张凡，2012)，蚊虫肠道中是否存在抑制白僵菌的微生物还需要进一步的研究。自然界中很难达到要求的孢子悬浮液浓度，孳生水体的盐度、有机物种类以及水体温度均会影响真菌的致病性。综上几种原因，白僵菌对野外组蚊虫虽然表现出了较高的致病力，但是在利用白僵菌防治蚊虫时，其防治效果与实验室结果可能存在很大差异，推广应用前还需要进行大量的田间试验。另外，孳生环境中微生物对白僵菌致病性的影响也是今后研究的方向。