利用两种电泳技术分析番茄品种醇溶蛋白及其亲缘关系

康美玲，田忠景，许庆鹏

(枣庄学院 生命科学学院，山东 枣庄 277160)

利用两种电泳技术分析番茄品种醇溶蛋白及其亲缘关系

康美玲，田忠景，许庆鹏

(枣庄学院 生命科学学院，山东 枣庄 277160)

本文利用番茄种子醇溶蛋白电泳图谱鉴定番茄各个品种之间的亲缘关系，采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳( A- PAGE) 和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)对枣庄市售10种番茄品种的醇溶蛋白电泳图谱的分析.结果表明：不同物种间的醇溶蛋白谱带存在一定差异且这种差异反映一定的关系.10种番茄醇溶蛋白分离谱带8条，大部分具有5条相同谱带，少部分谱带数量较少，最少谱带4条，经过遗传相似性与遗传多样性分析番茄的亲缘关系，经过遗传多样性聚类分析，将10种番茄在一定水平上，聚为5类.为枣庄番茄品种的亲缘关系分析以及遗传育种工作提供了依据.

番茄；醇溶蛋白；电泳；A-PAGE；SDS-PAGE①

1 前言

1.1 醇溶蛋白的研究意义

种子贮藏蛋白是基因表达的产物直接而且稳定,能确实反映出不同基因型的类型、个体间存在的遗传差异[1]；而且这种差异不会受到植物生长环境的影响.所以，种子贮藏蛋白电泳分析在国内外受到普遍重视[2]，它在研究植物种子亲缘关系、起源、分类、演化等方面跟传统的植物学性状、特性鉴定比较更加深入、准确、快速[3].

1.2 番茄的醇溶蛋白的研究现状

近年来，李守明[4]等在利用两种电泳技术分析大麦品种的醇溶蛋白差异及亲缘关系研究的得出：目前， 利用蛋白质电泳鉴定品种的方法较多，主要分为酸性和碱性两大体系.盐溶蛋白SDS-PAGE 以及醇溶蛋白A-PAGE 因其具有丰富的多态性已被广泛用于品种鉴定、品质分析和种质资源筛选[5,6].贮藏蛋白电泳技术在不断地改进和完善, 并广泛应用于小麦[7-10]、玉米、大麦、棉花、辣椒、向日葵、大麦[11-14]等作物的品种鉴定.

种子蛋白电泳分析, 国内外在园艺作物上极少报道, 有关番茄的文献也很少[15].

张彦萍等[1]对番茄属部分种的亲缘关系电泳检测研究中只采用了A-PEGE电泳技术对番茄品种醇溶蛋白进行了电泳实验.结果表明: 物种间的醇溶蛋白图谱差异能够反映一定的关系；醇溶蛋白分析支持了将醋栗番茄和小花番茄分别独立为种的观点, 樱桃番茄是普通番茄祖先.

1.3 选题依据

番茄属包括栽培番茄及其近缘的野生种，种质资源非常丰富.番茄属的分类经历了一个相当长的过程，研究者众多，但至今对其属中的划分仍存在许多分歧，尤其是该属植物物种间亲缘演化关系至今仍然不清楚，且某些物种系统发育地位尚未确立.这影响了番茄种质资源的整理和研究利用.番茄属分类及亲缘演化关系的研究，对于遗传育种和生产实践有着十分有价值，必须深入研究[16].

本研究利用SDS-PEGE[17-18]技术和A-PEGE[19]电泳技术对番茄属的醇溶蛋白多样性进行分析，意义在于为该属植物的分类和物种间亲缘关系，以及种子遗传纯度鉴定提供一些蛋白质方面的资料，并且比较两种电泳技术，哪一种更加准确的测定番茄的醇溶蛋白.

2 材料与仪器

2.1 试验材料

枣庄市售的10种番茄： 禧庆红梨；西丰粉丽；禧庆红珠；白果强丰；黄贵妃；樱桃番茄；帝皇红樱桃；中蔬四号；富贵娇粉；台湾圣美；L-402太空番茄

2.2 主要仪器

DDY-6C型电泳仪电泳槽(北京市六一仪器厂)

pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)

高速冷冻离心机(上海飞菲恰尔析仪器有限公司)

3 试验方法

3.1试剂配制

30% Arc-Bis母液：称取30g丙烯酰胺和0.45gN-N甲叉双丙烯酰胺加超纯水定容到100ml.

分离缓冲液：称取20.7g Tris，用少量溶解后，以1N Hcl调节pH到8.8定容100ml 4℃存放.

浓缩胶缓冲液：取4.36g Tris，用少量溶解后，以1N Hcl调节pH到6.8定容100ml 4℃存放.

10%SDS：10g SDS溶于100ml水中，室温存放

SDS-PAGE电极缓冲液：称取15g Tris，72g甘氨酸5g SDS溶于水中以1N Hcl调节pH到8.3后定容1000ml，4℃存放用前稀释5倍

1N HCl：5ml 36%HCl加水定容到100ml

A-PAGE凝胶缓冲液：0.845ml冰乙酸加0.0854g甘氨酸加水定容到1000ml

A-PAGE电极缓冲液4ml冰乙酸加0.4g甘氨酸加水定容到1000ml

0.2%硫酸亚铁：0.1 g硫酸亚铁溶于50 ml水中

4%维生素C：0.4 g维生素C溶于10 ml水中

24%尿素：12g尿素溶于50 ml水中

样品提取液：4.2 ml dH2o+1 ml0.5M Tris-HCl(pH6.8)+0.8ml甘油+0.4 ml巯基乙醇+1.6ml 10%SDS

染色液5g考马斯亮蓝加少量乙醇溶液后加水定容到100ml

脱色液：10ml甲醇+10ml95%乙醇+10ml冰乙酸加水定容到100ml

3.2试验方法

3.2.1样品提取

将10种番茄种子编号充分研磨后，各取0.2g放于10ml离心管中加样品提取液室温浸提过夜[20].

3.2.2制胶

3.2.2.1 SDS-PAGE制胶

表1 SDS-PAGE制胶配方表

3.2.2.2 A-PAGE制胶

表 2 A-PAGE制胶配方表

3.2.3 点样与电泳

点样量10-20μL，SDS-PAGE 10mA恒流，A-PAGE 80V稳压，直至溴酚蓝标记离开胶板底部.

3.2.4 染色与脱色

凝胶经染色液染色24h，用蒸馏水冲洗后再用脱色液脱色24-48h拍照读带.

3.2.5 计算相对迁移率和遗传相似系数

Rf=蛋白质谱带迁移距离/前沿指示剂迁移距离

GS=形同谱带数×2/总谱带数

GD=1-GS

4 结果与分析

4.1 醇溶蛋白谱带多样性分析

图1 SDS-PAGE凝胶电泳谱带 图2 A-PAGE凝胶电泳图

表3 番茄遗传多样性GD

普通番茄与其他品种番茄之间有明显差异(图 1)普通番茄Rf(0.688)和Rf(0.563)特征带，且Rf(0.688)谱带活性强，樱桃番茄属属于过渡类型不具有Rf(0.688)但是具有Rf(0.563)的条带特性，本试验中不存在野生种，所以野生种的谱带无法进行对比.

通过表3中可以看出所有的番茄亲缘关系都比较接近，也说明了番茄种间差异较小，观察表格可以发现，主要分为，樱桃番茄和普通番茄两类，(GD差异越小，亲缘关系越近)1号(禧庆红梨)2号(禧庆红珠)亲缘关系极近，3号(西丰粉丽)和4(白果强丰)号亲缘关系较近，5号(黄贵妃樱桃番茄)6号(帝皇红樱桃)的关系极近差异都在0.07左右 ，7号(中蔬四号)、8号(富贵娇粉)、亲缘关系很近9号(l-402太空番茄)、10号(台湾圣美)亲缘关系很近，4号(白果强丰)对其他品种的GD值相对偏大，但是不是很大，说明亲缘关系也是很近的.从而说明了番茄中间的差异很小，分类比较复杂.

4.2 番茄品种的聚类分析

图3 番茄遗传差异聚类分析

对10种番茄品种醇溶蛋白间的遗传差异进行聚类分析，从图 3可知，10种大番茄品种的遗传相异系数在5.21水平上全部聚为一类，其中1号(禧庆红梨)2号(禧庆红珠)在1.04水平上聚为一类，说明两者之间亲缘关系很近，3号(西丰粉丽)和4(白果强丰)号在1.30水平上聚为一类，说明两者关系很近，5号(黄贵妃樱桃番茄)6号(帝皇红樱桃)在1.54水平上聚为一类，说明两者关系很近，7号(中蔬四号)8号(富贵娇粉)在1.54水平上聚为一类，说明两者之间关系很近，9号(l-402太空番茄)10号(台湾圣美)在1.30水平上聚为一类，说明两者之间关系很近，3号(西丰粉丽)、4号(白果强丰)、5号(黄贵妃樱桃番茄)、6号(帝皇红樱桃)在2.45水平上聚为一类，说明四者之间关系很较近，7号(中蔬四号)、8号(富贵娇粉)、9号(l-402太空番茄)、10号(台湾圣美)在2.38水平上聚为一类，说明四者之间关系很近，有6个品种1号(禧庆红梨)、2号(禧庆红珠)、3号(西丰粉丽)、4号(白果强丰)、5号(黄贵妃樱桃番茄)、6号(帝皇红樱桃)在3.23水平上聚为一类，说明者六个品种之间存在一定亲缘关系.

综上所述，根据番茄的外形、颜色、蛋白质谱带、GD 值和聚类分析，发现枣庄市售的番茄品种基本上都属于普通种番茄与樱桃番茄属，或者为普通番茄与樱桃番茄的杂交种，种间差距较小，亲缘关系都非常接近.

5 结论

本文通过番茄种子醇溶蛋白的电泳分析，发现其电泳谱带稳定、清晰、条带多、重复性好，能够反映不同物种之间的遗传差异，可以作为亲缘关系分析、遗传育种研究的理论依据.番茄种子内间醇溶蛋白谱带差异小，栽培品种与突变品种的谱带基本一致，表明番茄属醇溶蛋白谱带相似值与亲缘关系表现了平行性，可以作为系统分类的一个标准.本试验首次利用SDS-PAGE凝胶电泳，对番茄遗传性反复研究，经反复试验，得出了一套适合番茄遗传性进行分析的定量种子的方法、凝胶浓度、电泳条件.经对比，发现SDS-PAGE电泳比A-PAGE电泳谱带更加清晰，试验方法更加简便快速，且分辨率高，重复性好，可作为以今后试验的方法进行推广.

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UsingTwoKindsofElectrophoresisAnalysisofTomatoVarietiesGliadinandAffinity

KANG Mei-ling,TIAN Zhong-jing,XU Qing-peng

(Department of Life Science, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160,China)

In this paper, tomato seeds tomato gliadin patterns identified the genetic relationship between the various varieties, the use of acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) on 10 kinds of commercially available tomato varieties Zaozhuang gliadin electrophoresis pattern analysis. The results showed that: different species of gliadin bands there are some differences and these differences reflect a certain relationship. 10 kinds of tomatoes isolated gliadin bands 8, most of them have the same five bands, a small part of the small number of bands, at least four bands, through genetic similarity and genetic diversity of tomato genetic relationship, after cluster analysis of genetic diversity, the 10 kinds of tomatoes at a certain level, clustered into five categories. Tomato varieties of Zaozhuang kinship analysis, and provide a basis for genetic breeding.

tomato;gliadin;electrophoresis;A-PAGE; SDS-PAGE

QZ91

A

1004-7077(2013)05-0127-06

2013-08-10

康美玲(1977-)，女，山西运城人，枣庄学院生命科学学院讲师，理学硕士，主要从事生物化学及细胞生物学方面的研究.

胡勤忠]