海藻酸钠包埋肝素钠及其缓释效果

邓艳美,丁诚实,刘辉辉

(枣庄学院 生命科学学院，山东 枣庄 277160)

海藻酸钠包埋肝素钠及其缓释效果

邓艳美,丁诚实,刘辉辉

(枣庄学院 生命科学学院，山东 枣庄 277160)

选取最佳的海藻酸钠包埋浓度，并对肝素钠在海藻酸钠颗粒中的释放效果进行研究. 采用的是可见分光光度法测定肝素钠的含量，以此测得肝素钠的包封率及其缓释效果.海藻酸钠包埋的最佳浓度是5mg/L，肝素钠的包封率是86%，海藻酸钠包埋的颗粒对抗凝血时间延长了一半.

海藻酸钠；肝素钠；包埋；缓释①

0 引言

肝素钠是一种含有硫酸基团的粘多糖，属于阴离子化合物.肝素钠作为抗凝药物，主要是加强抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的作用，ATⅢ与凝血酶相结合，形成 ATⅢ凝血酶复合物而使凝血酶失活，从而阻止凝血酶的形成并有阻止血小板聚集等抗凝作用[1].

包埋法是近年来发展迅速的一种新兴细胞固定化技术[2],它具有许多优点：(1)它操作简单,无需太多繁杂的步骤；(2)包埋好后对包埋的物质结构或是细胞活性影响较小；(3)效率高，其包封率一般都能达到60%以上.因此是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方一种法[3].海藻酸钠是从褐藻中提取出来的,由海藻酸钠制备的微球颗粒,具有许多优良的特点，如生物黏附性、生物相容性,并且无毒副作用,尤其是当海藻酸钠溶液滴入钙离子溶液时,很容易就形成微球颗粒,并且该过程十分柔和.海藻酸钠的这种良好的成球特性,能够使其适合包埋药物、蛋白质与细胞等物质,因此常被用作控释载体，并被广泛用于生物医学材料领域[4-7].

肝素钠含量的测定常采用的是生物学方法[8]、化学方法有分光光度法[9]、HPLC法[10]、毛细管电泳法[11]、电化学传感器[12]等方法.

本试验采用的是可见分光光度法.在特定的波长下得到某一吸光度值.但对较高浓度的肝素钠测定有局限性，必须稀释到低浓度下才可以进行测定.

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

肝素钠 (Regal Biotechnology Company)，兔全血，氯化钠，无水乙醇，氯化钙.

1.2 仪器

TM-1000扫描电镜(日本日立公司)；台式倒置荧光显微镜(深圳市叁诺西努科技有限公司)；紫外可见分光光度计(杭州惠尔仪器设备有限公司)；电子天平JT201N(上海精天仪器有限公司)；KDM型控温电热套(山东鄄城华鲁仪器公司)；MYB型调温电热套(华北实验仪器有限公司)等.

2 试验方法

2.1 海藻酸钠包埋肝素钠颗粒的制备

2.1.1 肝素钠溶液配制及标准曲线的绘制

购置的肝素钠为粉末状态，效价是≥170IU/mg.用生理盐水分别配置成0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1.0mg/ml的溶液，避光保存.五种溶液分别标记为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ.其对应的效价分别为34IU/ml，68IU/ml，102IU/ml，136IU/ml，170IU/ml.

本试验采用了紫外可见分光光度法测肝素钠含量，在430 nm处分别对上述五种浓度的肝素钠溶液测吸光度值[15].绘制标准曲线图.

2.1.2 海藻酸钠浓度对颗粒的影响

分别称取0.0625mg，0.125mg，0.1875mg，0.25mg，0.375mg海藻酸钠于烧杯中，加入25ml去离子水，在电热套中加热融化直至溶液较为均匀，配制成浓度分别为2.5mg/L，5.0mg/L，7.5mg/L，10.0mg/L，15.0mg/L的溶液.并从低浓度到高浓度依次标号为1号，2号，3号，4号，5号.用5ml医用针管吸取海藻酸钠溶液并滴入到CaCl2溶液中，放置半小时左右.

2.1.3 颗粒的包埋及包封率的测定

取1.0ml浓度为0.2mg/ml的肝素钠溶液加入到0.1ml的3% CaCl2溶液中，混匀待用.用5mL医用注射器吸取已配置好的5mg/L的海藻酸钠溶液，一滴一滴的慢速注入到上述混匀的溶液中，静置半小时左右，以便形成圆形颗粒.将颗粒取出放在倒置显微镜及扫描电镜下观察，测量总长度，并求得其平均直径.

包封率公式计算为：M包/M总×100%，M包是包埋在海藻酸钠颗粒里面的肝素钠含量，M总是未包埋之前肝素钠的总含量.

2.2颗粒的初步缓释效果

2.2.1海藻酸钠肝素钠颗粒释放程度的测定

取同样肝素钠浓度的颗粒，将颗粒放在生理盐水中，再置于37℃恒温水浴箱中，使其进行肝素钠样品的释放，每隔2小时取溶液进行紫外可见分光光度测定.

2.2.2海藻酸钠肝素钠颗粒在兔血中的初步缓释效果

将包埋好的颗粒用蒸馏水冲洗2遍并自然晾干.准备10支1.5 ml的EP管，5种浓度的包埋好的颗粒，将包埋好的颗粒分别放入5支EP管中，加入少量的生理盐水使其均匀的悬浮在EP管中；另外5支EP管分别加入0.5mL的肝素钠溶液.

对兔子心脏部位的皮肤进行消毒，用一次性医用针管从兔子的心脏中采集新鲜的血液，并将采集的新鲜血液立即注入到10支1.5mL的EP管中，每管含量约为1ml.对EP管进行摇晃使颗粒在EP管中尽量分布均匀.将EP管放入到37℃恒温水浴箱中，计时并且每隔15min慢慢倾斜EP管，观察血液还是否流动，直到凝固为止，记录血液凝固时间.

3 试验结果与分析

3.1 不同浓度海藻酸钠对颗粒的影响及肝素钠的标准曲线图

据五种浓度的肝素钠绘制的标准曲线图：y=-0.1895x+1.3329,R2=0.9991.

图1 肝素钠含量标准曲线图

图2至图6为五种不同浓度的海藻酸钠形成的颗粒，颗粒形成时未加入肝素钠样品.

图 2 1号浓度海藻酸钠 图3 2号浓度的海藻酸钠

图4 3号浓度的海藻酸钠 图5 4号浓度的海藻酸钠

图 6 5号浓度的海藻酸钠

表1为不同浓度的海藻酸钠颗粒描述，表中将从颗粒的圆滑度，有无拖尾现象及硬度来对包埋好的颗粒进行描述.

表1 不同浓度的海藻酸钠颗粒描述

从图3可知2号浓度的海藻酸钠形成的颗粒比较圆并且形成的粒径比较均一，拖尾现象几乎没有.所以采用2号浓度的海藻酸钠包埋肝素钠即5 mg/L浓度的海藻酸钠.

3.2 包埋好的海藻酸钠肝素钠颗粒结果

肉眼观察已经包埋好的海藻酸钠肝素钠颗粒，颗粒图片见图7.

图7 包埋好的海藻酸钠肝素钠颗粒

图7显示了包埋好的海藻酸钠肝素钠颗粒，其颗粒形态比较均一，几乎无拖尾现象.初步包埋比较成功.

将包埋好的颗粒取出后，对剩余的溶液进行紫外可见分光光度测定.其吸光度值为1.3276，代入标准曲线公式算得肝素钠的含量为0.028mg.所以包封率为86%.

包埋好的海藻酸钠肝素钠颗粒放在倒置荧光显微镜下观察.颗粒图片见图8.

图8 倒置显微镜下包埋颗粒情况 40×

图 8(a)和图 8(b)是从不同的角度观察颗粒的形态结构.从图 8中可以看到包埋的颗粒不是标准的圆，图中的显示的颗粒透明度不均一，这可能是因为颗粒有空隙或是光度太强使得透明度加大了.

为了更好的观察颗粒的表面状况，对包埋好的海藻酸钠肝素钠颗粒进行扫描电子显微镜的观察并求得其平均直径为0.42mm.见图 9.

图9 包埋颗粒在扫描电镜下的情况

图 9(a),图 9(b),图 9(c)分别是在40×，120×，300×下的照片.由图 9(b)显示颗粒的表面凹凸不平，而且还有缝隙，这正是被包埋的肝素钠样品进行释放到颗粒外面所必需的.同时，也是肝素钠进行缓释作用所必需的.

由图 9(c)的放大倍数是300×，从图中计算颗粒的平均直径为0.42mm，可以进行体外抗凝血试验.由于颗粒不是正球体，所以我们求得的直径是一个平均数.

3.3 海藻酸钠肝素钠颗粒缓释效果的初步结果

每隔2小时取溶液进行紫外可见分光光度计测定，得到如表2的结果.

表2 肝素钠在海藻酸钠颗粒中的释放程度

包埋了肝素钠的海藻酸钠颗粒在生理盐水中进行了12h的释放，释放时间一直是持久的.其缓释效果也比较明显，预计能在血液抗凝方面起到一定的作用.

不同浓度的肝素钠在包埋时和未包埋时抗凝血时间见表3.

表3 不同浓度肝素钠包埋颗粒抗凝血时间

由表3可知，包埋组每一管的抗凝血时间明显比未包埋组的抗凝血时间延长了许多，延长时间能延长接近未包埋时抗凝时间的一半.这也充分证明了海藻酸钠包埋肝素钠的可行性并且其缓释的初步效果还是不错的.被包埋的不同浓度的肝素钠，它的抗凝时间也不一样，随着肝素钠浓度的加大，抗凝时间也延长.表3中列出了一些在不同肝素钠浓度下的抗凝时间，这也为临床医学提供了一定的临床参考价值.

[1]汪家铭.肝素钠生产开发前景看好[J].四川化工与腐蚀控制，2000,1(3):61-62.

[2]肖美燕,徐尔尼,陈志文.包埋法固定化细胞技术的研究进展[J].食品科学,2003,24(4):158-161.

[3]黄霞,俞毓馨,王蕾.固定化细胞技术在废水处理中的应用[J].环境科学,1993,14(1):41-48.

[4]李超敏,韩梅,张良,等.细胞固定化技术——海藻酸钠包埋法的研究进展[J].安徽农业科学, 2000, 34 (7) : 1281 - 1282, 1284.

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SodiumAlginateEmbeddingHeparinSodiumandItsReleaseEffect

DENG Yan-mei,DING Cheng-shi,LIU Hui-hui

(Department of life science,zaozhuang university, zaozhuang 277160 ,China)

The best concentration of the Sodium alginate was selected and study on the release effect of Heparin sodium in the Sodium alginate particles. The content of Heparin sodium was determined by Spectro-photometric method. In addition, the encapsulation efficiency of Sodium alginate in the particles and the release effect was tested. He best concentration of Sodium alginate for embedding was 5mg/L; The encapsulation efficiency in particles was calculated at 86%; Sodium alginate particles did play a significant role in delaying blood agglutination and its delaying can be one and a half of the initial effect.

sodium alginate; heparin sodium; embedding; sustained-release

Q539.7

A

1004-7077(2013)05-0118-06

2013-08-15

邓艳美(1977- )，女，山东枣庄人，枣庄学院生命科学学院讲师，硕士研究生，主要从事生物制药研究.

胡勤忠]