盈江县耕地土壤高效解磷菌的分离筛选研究

2013-11-09钟小玉于波张晨光

资源节约与环保 2013年8期

钟小玉于波张晨光

（1河源市清洁生产中心广东河源 517000 2青岛中一监测有限公司山东青岛 266000 3德宏州环境保护局云南德宏 678400）

磷是农作物生长所必需的三大元素之一。土壤中全磷的含量是十分丰富的，但是可利用的有效磷含量极低，一般当季作物只能吸收5~10%的磷肥，而其中大部分的磷会固定在土壤中，以无效态磷的形式存在，尤其在暴雨冲刷、下渗、侧渗情况下，磷就会进入湖泊、水库造成水体富营养化。如何利用土壤中无效态的磷成了国内外众多农业和环境领域学者所研究的热点课题。

1 材料与方法

一般来说，采样的最佳时间为晚秋或早春采集土样，根据实验安排采样时间定为2012年10月23日。

1.1 培养基的制备

根据余贤美等[1]的研究结果，以有机磷液体培养基作为生物富集培养基，然后在无机磷固体培养基上进行平板稀释法筛选，可以有效的分离筛选土壤中的解磷细菌。

无机磷细菌固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.5g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Ca3(PO4)210g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，琼脂粉 18~20g/L，蒸馏水 1L，pH 7.0~7.5。有机磷细菌液体培养基：葡萄糖 10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO3 5.0g，（NH4）3PO40.5g，加蛋黄液10mL(蛋黄液为无菌生理盐水与鸡蛋黄1:1配制)，蒸馏水1L，pH7.0~7.5。（生理盐水：9gNaCl溶于1L水中）。本研究中所用的试剂均为国产分析纯试剂。斜面保存培养基（LB培养基）：胰化蛋白胨10g，酵母膏 5g，NaCl10g，琼脂 20g，H2O1L。

1.2 高效解磷菌的分离与筛选

解磷菌的生物富集：称取处理后的土样1g加入到100mL有机磷液体培养基中，于28℃，200～250r/min条件下振荡培养48h。

平板稀释法分离解磷细菌：按 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的梯度进行稀释，对最后5个稀释梯度各取0.2mL上清液，每个稀释度做3次重复，分别在无机磷或有机磷固体培养基平板上涂布均匀，置于28℃培养箱中培养7d，观察平板中菌落生长情况及溶磷圈的产生。将固体培养基上长出的单菌落分别在无机磷细菌固体培养基平板上进行四分体划线分离及纯化，以获得纯菌株。并根据溶磷圈直径与菌落直径的比值筛选目标菌株，并把比值较大的菌株保存在斜面培养基上，放在4℃冰箱中保存备用。

1.3 水溶性磷测定方法

将纯菌株从斜面接种到无机磷固体培养基上，培养7d，再将菌落刮入无菌水中，制成菌体悬浮液，浓度约为108cuf/mL。向250ml三角瓶中加入100ml无机磷液体培养基，再接入2ml菌液，同时做空白对照。28℃，转速200~250r/min，连续培养14d，每隔24h取菌液，3000r/min离心、0.45μm滤膜过滤后，用磷钼蓝比色法测定滤液中的水溶性磷含量，连续测定14d。