食管癌组织中COX－2与PTEN、E－cadherin表达及临床病理的关系

李昌秀，徐红梅，杨达荣，杨 柳，吴时军，张 黎，曹友德 (.重庆市合川区人民医院病理科，重庆 4050;.重庆医科大学病理学教研室，重庆 40006)

食管癌组织中COX－2与PTEN、E－cadherin表达及临床病理的关系

李昌秀1，徐红梅1，杨达荣1，杨 柳1，吴时军1，张 黎1，曹友德2(1.重庆市合川区人民医院病理科，重庆 401520;2.重庆医科大学病理学教研室，重庆 400016)

目的:探讨COX－2与PTEN及E－cadherin在食管癌组织中的表达及意义，以期了解三者在食管癌发生、发展及转移中的相互作用。方法:采用免疫组化法分别检测COX－2、PTEN、E－cadherin在60例食管癌组织中的表达情况及相互关系。结果:COX－2在食管癌组织中的表达为70.00%，明显高于在正常食管鳞状上皮中的表达(P＜0.01)。而PTEN及E－cadherin在食管癌中表达分别为43.33%和38.33%，明显低于两者正常食管组织中的阳性率(P＜0.01)。在食管癌中COX－2表达与PTEN、E－cadherin的表达及分化程度呈一定的负相关，而与淋巴结转移呈正相关。而PTEN及E－cadherin的表达与淋巴结转移呈负相关。结论:COX－2、PTEN及E－cadherin共同参与食管癌的发生且影响癌细胞转移;食管癌中COX－2与PTEN及E－cadherin的表达呈负相关性;联合检测COX－2、PTEN及E－cadherin有望成为食管癌早期诊断、评估生物学行为及预后的重要指标。

食管癌;环氧化酶－2(COX－2);PTEN;E－cadherin;免疫组化

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一 ，其发生、发展是一个复杂的过程，与多个基因或多个分子水平变化密切相关。近期研究发现在一些肿瘤中环氧化酶－2(cyclooxygenase－2，COX－2)的表达与第10号染色体同源丢失性磷酸酶和张力蛋白基因 (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)和 E－钙黏蛋白(E－cadherin，E－CD)表达呈负相关，而在食管癌中COX－2与PTEN及E－cadherin的表达是否也有密切的相关性目前尚未见报道。本研究用免疫组化法联合检测食管鳞癌组织中三者的表达情况，以期探讨其表达水平与在食管癌的发生、发展及转移的关系。

1 材料与方法

1.1 病例选择:收集我院2005年～2011年食管癌根治切除的石蜡标本60例。60例食管癌组织标本经病理组织学证实为鳞状细胞癌，术前均未行放疗及化疗。其中男38例，女22例;年龄46～79岁，平均(63.4±7.6)岁;有淋巴结转移36例，无淋巴结转移24例。癌旁正常黏膜组织(距癌组织3 cm以上，经病理证实为分化良好的鳞状上皮及少量固有层成分)40例作为正常对照。

1.2 主要试剂及方法:COX－2单克隆抗体(工作液)、PTEN单克隆抗体、E－cadherin单克隆抗体、SP试剂盒均及DAB显色液购自福建迈新生物工程有限公司。组织经10%甲醛固定，4 μm连续石蜡切片。采用SP免疫组化染色法，按照SP检测试剂盒说明书的步骤操作。

1.3 结果的判定:参照许良中的资料［1］，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量判断结果。即先在低倍镜下取选抗体表达部位(细胞浆、膜或核)的最强着色区，然后选10个高倍镜视野(×400)，分别记数100个细胞，其颜色深浅参考文献评分:无棕黄色颗粒为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色细胞所占百分比打分:无阳性细胞为0分，1% ～10%为1分，11% ～50%为2分，≥51%为3分。两项乘积得分≥3分定为阳性。

1.4 统计学分析:采用SPSS 13.0软件进行分析，计数资料进行χ2检验;两个变量相关性分析采用双变量相关分析P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX－2与PTEN及E－cadherin在食管癌中的表达:COX－2蛋白阳性产物为棕黄色颗粒，位于食管癌细胞胞质内，为强表达(见图1A);PTEN在正常食道鳞状上皮中表达于细胞核，为强表达(见图1B);E－cadherin在正常食道鳞状上皮中表达于细胞膜(见图1C)。COX－2在食管癌组织中的表达明显高于在正常食管鳞状上皮中的表达(P＜0.01)。而PTEN及E－cadherin在食管癌中表达分别为43.33%和38.33%，明显低于两者正常食管组织中的阳性率(P＜0.01)。见表1。

表1 COX－2、PTEN及E－cadherin在食管癌中的表达

注:与正常食管组织比较，①P＜0.01

表2 COX－2与PTEN及E－cadherin在食管癌中的表达与临床病理的关系

2.2 COX－2与PTEN、E－cadherin在食管癌中的表达及临床病理的关系:在食管癌中COX－2表达与PTEN表达、E－cadherin的表达及分化程度呈一定的负相关，而与淋巴结转移呈正相关。分化程度与PTEN及E－cadherin的表达无明显相关。PTEN及E－cadherin与淋巴结转移的表达呈负相关。而PTEN、E－cadherin及COX－2在食管癌中的表达与患者的性别及年龄无相关性(P＞0.05)。见表2。

图1C E－cadherin在食管正常组织中的表达(SP×200)

3 讨论

近年来COX－2在多种肿瘤中表达情况受到关注，已从多方面证明COX－2在多种恶性肿瘤中表达上调，并且与肿瘤的发生及侵袭转移密切有关［2－3］。COX－2可通过刺激肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、抑制机体免疫功能等促使癌前病变向肿瘤转化，可以通过促进脉管形成参与浸润转移。本研究显示，食管癌组织中COX－2的表达阳性率为70.00%，较正常食管组织中COX－2的表达明显升高，且与肿瘤的分化程度(r= －0.585，P＜0.01)、淋巴结转移情况(r=0.501，P ＜0.01)相关。Al－Maghrabi等对94例结直肠癌病例的分析发现COX－2与结直肠癌的分期、远处转移及淋巴管转移明显相关［4］。提示COX－2参与了食管癌的发生、发展及转移，可能是食管癌发生的一个早期事件和预后不良的指标。

PTEN基因作为第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其在众多恶性肿瘤中存在突变、缺失或低表达，导致其抑癌功能减弱或丧失。Hafsi等发现PTEN的过甲基化导致PTEN低水平转录及PTEN蛋白的减少甚至缺失［5］，从而引起胃肠道上皮过度增生进而形成肿瘤。笔者的研究结果也显示食管癌中PTEN的阳性表达率(43.33%)显著低于正常食管组织(92.5%)(P＜0.01)，且淋巴结转移组中PTEN表达明显低于无淋巴结转移组(P＜0.01)。这与Ettl等在涎腺癌中的研究结果一致［6］，我们推测PTEN蛋白可能对肿瘤细胞的迁移有抑制作用，是食管癌转移的负相关因子。

E－cadherin是重要的钙依赖性黏附分子，可通过细胞接触抑制作用阻碍肿瘤细胞的去分化和恶性增殖，同时可通过保持细胞黏附，抑制肿瘤细胞的浸润或脱离原发部位向局部淋巴结或远处转移。Saad等研究表明E－cadherin缺失或低表达可以成为预测胃癌疾病进展、淋巴结转移及预后评估的有效指标，甚至可以作为肿瘤转移的一个标志物［7］。本研究结果也显示食管癌中的阳性表达率(38.33%)显著低于正常食管组织(87.5%)(P＜0.01)，且淋巴结转移组中E－cadherin表达明显低于无淋巴结转移组(P＜0.01)。这提示可能在食管癌发生早期E－cadherin基因就已经发生改变，并随肿瘤的进展最终完全消失，致使维持细胞间紧密连结、聚集的黏附系统功能丧失，促使细胞恶性转化、增殖及侵袭转移能力增强。

有学者发现选择性COX－2抑制剂可上调胃癌细胞PTEN基因表达，并推测COX－2和PTEN在肿瘤的发生过程中起着协同作用［8］。我们的研究结果也显示在COX－2阴性组中食管癌PTEN表达阳性率为77.78%，显著高于COX－2阳性组(28.57%)，两者表达之间存在显著的负相关(r=－0.615，P＜0.01)。St－Germain等用PI3K抑制剂作用于子宫内膜癌细胞株后［9］，Akt磷酰化被抑制的同时COX－2的表达也减低。而PI3K的产物PIP3与细胞内含有pH结构域的Akt和PDK1结合后激活Akt，且PTEN能够使PIP3去磷酸化，从而推测COX－2可能通过PI3K/Akt通路参与PTEN的调控。我们的研究显示在食管癌COX－2与E－cadherin的表达(r=－0.415，P＜0.01)也呈一定的负相关，这与Jang等在膀胱移行细胞癌发现COX－2与E－cadherin呈负相关基本一致［10］。同样Luo等用RT－PCR技术检测了塞来昔布作用鼻咽癌细胞后细胞的转移能力明显被抑制［11］，发现细胞的E－cadherin mRNA量较正常组明显增加，说明COX－2抑制剂能够增加E－cadherin的表达。而且有学者发现术前短期应用塞来昔布可提高E－cadherin表达水平，对胃癌浸润转移具有潜在的治疗意义，同时耐受性良好［12］。但是关于COX－2如何调节E－cadherin表达，至今还未见报道。

总之，本研究显示COX－2与PTEN及E－cadherin存在负相关，COX－2可能通过某种机制负调控PTEN及E－cadherin，参与食管癌细胞的发生、浸润和转移，联合检测三者将有助于临床评估病情和判断预后，对食管癌的基因靶向治疗也提供了一定的方向。但是还需要进一步用基因及蛋白定量等方法去证实食管癌中COX－2、PTEN及E－cadherin的相关性，而且关于COX－2、PTEN及E－cadherin共同参与食管癌演化过程的具体机制还需进一步探讨。

［1］ 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判定标准［J］. 中国癌症杂志，1996，6(4):229.

［2］ Mohammad S，Ram H，Gupta PN，et al.Overexpression of COX－2 in oral squamous cell carcinoma patients undergoing chemoradiotherapy［J］.Natl J Maxillofac Surg，2011，2(1):17.

［3］ Almeida PR，Ferreira FV，Santos CC，et al.Immunoexpression of cyclooxygenase－2 in primary gastric carcinomas and lymph node metastases［J］.World J Gastroenterol.，2012，18(8):778.

［4］ Al－ Maghrabi J，Buhmeida A，Emam E，et al.Cyclooxygenase－2 expression as a predictor of outcome in colorectal carcino-ma［J］.World J Gastroenterol，2012，18(15):1793.

［5］ Hafsi S，Pezzino FM，Candido S，et al.Gene alterations in the PI3K/PTEN/AKT pathway as a mechanism of drug－resistance［J］.Int J Oncol，2012，40(3):639.

［6］ Ettl T，Baader K，Stiegler C，et al.Loss of PTEN is associated with elevated EGFR and HER2 expression and worse prognosis in salivary gland cancer［J］.Br J Cancer，2012，106(4):719.

［7］ Saad AA，Awed NM，Abd Elkerim NN，et al.Prognostic significance of E－cadherin expression and peripheral blood micrometastasis in gastric carcinoma patients［J］.Ann Surg Oncol，2010，17(11):3059.

［8］ Honjo S，Osaki M，Ardyanto TD，et al.COX － 2 inhibitor，NS398，enhances Fas－ mediated apoptosis via modulation of the PTEN － Akt pathway in human gastric carcinoma cell lines［J］.DNA Cell Biol，2005，24(3):141.

［9］ St－ Germain ME，Gagnon V，Mathieu I，et al.Akt regulates COX－2 mRNA and protein expression in mutated－PTEN human endometrial cancer cells［J］.Int J Oncol，2004，24(5):1311.

［10］ Jang TJ，Cha WH，Lee KS.Reciprocal correlation between the expression of cyclooxygenase－2 and E－cadherin in human bladder transitional cell carcinomas［J］.Virchows Arch，2010，457(3):319.

［11］ Luo WR，Li LX，Li SY，et al.Influence of celecoxib on invasiveness of human high－metastatic nasopharyngeal carcinoma cell line CNE －2Z［J］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2010，45(11):941.

［12］ Ran JT，Zhou YN，Tang CW，et al.Short－ term preoperative treatment of celecoxib，a selective cyclooxygenase－2 inhibitor，on E － cadherin expression in gastric carcinoma tissues［J］.Ai Zheng，2009，28(4):361.

Expression of COX －2，PTEN and E －cadherin in esophageal carcinoma and their correlation with clinical－pathological characteristics

LI Chang － xiu，XU Hong － mei，YANG Da － rong，et al.(Department of Pathology，People's Hospi-

tal of Hechuan District，Hechuan 401520，China)

Objective To investigate the expression of COX－2，PTEN and E－cadherin in the esophageal carcinoma and to explore their interactions.Method The expression of COX －2，PTEN and E －cadherin was evaluated in 60 cases with esophageal carcinoma by immunohistochemical staining methods.Results The positive rate of COX－2 was 70.00%，which was significantly higher in esophageal carcinoma than that in normal squamous cell of esophagus(P＜0.01).The positive rate of PTEN and of E－cadherin was 43.33%and 38.33%respectively，which was significantly weaker in esophageal carcinoma than that in normal squamous cell of esophagus(P ＜0.01).The expression of COX－2 was negatively correlated with PTEN，E －cadherin and differentiating degree.But it was positively correlated with the lymph－node metastasis.The expression of PTEN and E－cadherin was negatively correlated with the lymph－node metastasis.Conclusion COX －2，PTEN and E －cadherin may play an important role in esophageal carcinoma development and lymph node metastasis.The expression of COX－2 is negatively correlated with PTEN and E－cadherin in esophageal carcinoma.There may be an interaction action among COX －2，PTEN and E －cadherin.Expressions of COX －2，PTEN and E －cadherin may be helpful in early diagnosis and evaluation of the biological behavior and prognosis of esophageal carcinoma.

Esophageal carcinoma;Cyclooxygenase－2;PTEN;E－cadherin;Immunohistochemical staining

重庆市卫生局医学科技项目［项目编号:2010－2－433］通讯作者:曹友德

2012－06－28 编校:潘宏竹］