HPLC法测定不同产地山药饮片中尿囊素和腺苷的含量*

★ 郑琴 胡鹏翼 龚莹莹 伍振峰 岳鹏飞 杨明*

（江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌330004）

山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎。具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的功能，主治脾虚食少、久泻不止、肺虚喘咳、肾虚遗精、带下、尿频、虚热、消渴等症[1]，是中药常用药物之一。据现代医学研究，山药富含皂苷、粘液质、糖蛋白、甘露聚糖、植酸、尿囊素、山药素、胆碱、多巴胺、粗纤维、果胶、淀粉酶以及多种微量元素等[2]。2010年版《中国药典》一部中收载了性状、鉴别、检查和浸出物等项目，但缺少含量测定项，不足以对饮片质量进行全面有效的控制。本文建立了山药饮片中尿囊素、腺苷的高效液相色谱的含量测定方法，测定了不同产地山药饮片中尿囊素及腺苷的含量，从而为山药的质量研究提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪；ΜV2550紫外分光光度计（岛津）；KQ-E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有公司）；BSA223S sartoris分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；BP211D电子天平（美国Sartorius公司）。

1.2 试药

尿囊素标准品（中国药品生物制品鉴定所，批号为11501-200202）；腺苷标准品（中国药品生物制品鉴定所，批号为110879-200202）；山药饮片收集于各产地，经江西中医学院龚千峰教授鉴定为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb．的干燥根茎切制而成。甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号T20110217）；水为二次蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 尿囊素[3]色谱柱：Pinnacle Amina C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（80：20），流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长224 nm，进样量20 μL，理论板数按尿囊素峰计算应不低于3 000。对照品及样品HPLC见图1。

2.1.2 腺苷[4]Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以磷酸盐缓冲液（pH 6.5）［取0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液68.5 mL与0.01 mol/L磷酸氢二钠溶液31.5 mL混合］-甲醇（85：15）为流动相，流速1.0 mL/min；检测波长260 nm；柱温25℃；进样量20 μL；理论板数按腺苷峰计算应不低于3 000。对照品及样品HPLC见图1。

图1 尿囊素、腺苷对照品及山药样品HPLC

2.2 对照品贮备溶液的制备

精密称取尿囊素对照品9.20 mg置50 mL容量瓶中，加20%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，配成浓度为184 μg/mL；精密称取腺苷对照品2.02 mg置25 mL容量瓶中，加15%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，配成浓度为80.8 μg/mL。

2.3 供试品溶液的配制

2.3.1 尿囊素[5]精密称取山药饮片粉末（过3号筛）0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20%甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理0.5 h，放冷，再称定质量，用20%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜，取续滤液用于测定山药饮片中尿囊素的含量。

2.3.2 腺苷[6]精密称取山药饮片粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入15%甲醇10 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理0.5 h，放冷，再称定质量，用15%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液用于测定山药饮片中腺苷的含量。

2.4 线性关系考察

精密吸取尿囊素对照品贮备溶液0.5、1、1.5、2、3、4 mL至5 mL容量瓶中，20%甲醇稀释至刻度，摇匀后分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图；精密吸取腺苷对照品贮备溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中，15%甲醇稀释至刻度，摇匀后分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图；并以浓度（C）对峰面积（A）进行线性回归，得回归方程分别为A=5.5464C-0.5709（r=0.9994），A=69.628C-5.6118（r=0.9991），可见尿囊素在0.368-3.68 μg范围内与峰面积线性关系良好，腺苷在0.01616-0.1616 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液20 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定尿囊素、腺苷峰面积值，其RSD分别为1.12%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，室温放置，分别在0，1，2，4，8，12 h进样6次，测定尿囊素、腺苷峰面积值，其RSD分别为1.81%、0.98%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一供试品粉末（9号样品），按上述供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，分别进行测定，测得尿囊素、腺苷平均含量分别为5.5901 mg/g、0.0636 mg/g，RSD分别为2.03%、1.83%（n=6），表明本试验方法重复性良好。

2.8 回收率

取重复性试验项下的山药样品粉末6份，精密称定，按高、中、低3种浓度分别加入尿囊素、腺苷对照品溶液，按2.3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别进行测定，计算回收率。结果尿囊素、腺苷平均加样回收率为99.93%、99.86%，RSD分别为0.87%、1.12%，见表1、2。

表1 尿囊素加样回收率

表2 腺苷的加样回收率（n=6）

2.9 样品含量测定

取不同产地山药样品粉末各3份，精密称定，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定峰面积，按外标一点法计算含量。不同产地山药药材中尿囊素、腺苷含量测定结果见表3。

表3 不同产地山药药材中尿囊素、腺苷质量分数（n=3）

1-9 号样品分别购自江西南昌不同的药店；10号样品购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司；其中，1-5号产地为河南，6、7号产地为安徽，8、9号样品产地为广西，10号产地为河南。

3 讨论

本文曾采用HPLC法梯度洗脱同时测定山药饮片中尿囊素、腺苷的含量[7，8]，采用 phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0-5 mim，A为99%；5-15 min，A为99%-85%；15-23 min，A为85%）；流速1.0 mL/min；检测波长为258 nm；柱温为30℃，进样量20μL。结果，在该条件下尿囊素及腺苷与其他峰均能较好的分离，但样品中尿囊素、腺苷的含量差异较大，在建立方法学时难以兼顾，因此本文将山药饮片采用不同方法处理，检测尿囊素、腺苷的含量。

尿囊素极性很大，在反相色谱柱上保留时间很短，试验过程中用普通ODS C18色谱柱，采用了多种液相条件，结果尿囊素的保留时间短，分离度不好，因此改用了氨基柱，流动相：甲醇-水（80：20），流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长224nm，在该条件下山药中尿囊素峰形较好，与其他杂质峰分离较好。尿囊素热稳定性较差，本文采用超声提取以确保样品稳定。根据文献报道[9]对比40%甲醇、20%甲醇、40%乙醇、20%乙醇超声提取，结果以20%甲醇水溶液提取完全且峰形良好，并确定提取时间为30 min。

依次选用水、15%、50%，80%，95%乙醇为提取溶剂超声提取山药饮片中的腺苷，结果用15%乙醇提取效果最佳，高浓度的醇提取的腺苷峰型较差，故选定15%乙醇为提取溶剂。对超声、加热回流提取方法进行了考察，发现用二者差异不大，因此选择提取方法简便的超声法用于山药饮片中腺苷的处理方法。

2010年版《中国药典》一部中收载了性状、鉴别、检查和浸出物等项目，但缺少含量测定项，不足以对饮片质量进行全面有效的控制。目前对其化学成分的研究主要集中在多糖和尿囊素类成分，对其他成分的研究则相对较少，山药的质量控制模式还有待进一步优化[10]。腺苷为山药中的有效成分之一，可以作为山药以及山药相关产品的质量标准的指标性成分。本文建立的HPLC方法测定山药饮片中尿囊素和腺苷的含量，该法精密度高、操作简便、准确可靠，为山药饮片的全面质量控制提供了参考。

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