一罕见成骨不全IV型的基因诊断

郭奕斌 艾阳 蒋玮莹

成 骨不 全（Osteogenesis imperfecta，OI），又 称为脆骨病或Urolik 病、Lobstein 病、Van der Hoere病，是一类涉及骨发育不良、频繁骨折的少见、罕见性遗传性疾病，多数为常染色体显性遗传（AD），少数为常染色体隐性遗传（AR）。发病率国外报道为1/10000～1/30000，而中国人群约为 4/10000[1]。临床表现主要包括不同程度的骨折、骨畸形、骨脆性增加、蓝巩膜、牙本质发育不全、听力下降等。本病分为I～ Ⅷ八型[1～2]。其中，I型症状轻，无畸形；II型症状非常严重，围产期即死亡；III型中度至重度畸形；IV型中等畸形。这四型都是由COL1A1、COL1A2基因控制，都为AD遗传。Ⅴ型中等畸形，虽也是AD遗传，但致病基因至今未明。Ⅵ型中等至严重畸形，为AR遗传，致病基因也未明了。Ⅶ型中等畸形，AR遗传，致病基因为CRTAP；Ⅷ型严重畸形，围产期即死亡，AR 遗传，致病基因为 LEPRE1[1～2]。

临床相对常见的是成骨不全I型和II型，而IV型和其它类型罕见。I型、II型、IV型都是由I型胶原基因（COL1A1、COL1A2）突变所致，只是突变的部位和突变的性质不同而已。这两个基因分别位于17q21～22和7q22.1上。其中，COL1A1基因长18 kb，有51个外显子（exon）；COL1A2基因长38 kb，有52个外显子[1]。

成骨不全至今仍无切实有效的根治手段。因此，检出突变，明确诊断，阐明病因，对再次妊娠的高危胎儿实施产前基因诊断是目前防治该病的最佳应对策略和优生手段，也是开展孕早期诊断和胚胎植入前诊断的必要前提条件。下面对近期接诊的一疑似成骨不全IV型或其他类型患儿的基因诊断结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象

先证者：男，汉族，广东籍，就诊时1岁10个月，双侧蓝巩膜明显，就诊前已骨折两次。据述，患儿出生2个月时即发现右腿骨折，不能抬头。7个月时曾做过腰椎骶尾椎正侧位X线检查，结果显示：腰椎、骶尾椎生理弯曲度存在，椎体顺列正常，所见椎间孔、椎间隙未见变窄，余附件未见异常。1岁4个月时曾做过右足部正斜位X线检查，结果显示：右足各跖趾骨结构完整，未见异常骨质改变，各个关节间隙正常。X光片诊断：腰椎、骶椎未见明显椎裂征象；右足未见异常X线征。1岁9个月时再次发生骨折，为右上肘发生关节脱位伴鹰嘴骨折。根据上述检查资料，拟诊为成骨不全，详细病因及分型待查。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA模板的制备

抽取外周血2管，每管3～4 mL，EDTA抗凝，按我室已建立的方法快速制备模板DNA[3]。

1.2.2 PCR扩增和电泳检测

COL1A1基因的引物参照文献[4]设计，由上海英潍捷基公司（Invitrogen company）和北京华大基因公司（BGI）分批合成。COL1A1基因各对引物的扩增条件和产物大小参照文献[1]。扩增产物用1.2%～1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭（0.5 mg/mL）或EB替代品GoldView（0.1 μL/mL）染色，紫外灯下观察扩增产物。

1.2.3 直接测序

将PCR产物交上海英骏公司或北京华大公司用ABI PRISM 3730型测序仪完成双向测序。

2 结果

2.1 PCR产物的电泳结果

图 1 为 COL1A1 基因 E（12～15）、E（2～5）、E1和E（46～47）扩增产物的电泳结果，各产物的分子量分别为 784 bp、1000 bp、349 bp 和 626 bp。M 为D2000 Marker。

2.2 测序结果

经DNA序列分析，发现在COL1A1基因第12外显子内存在一典型的杂合错义突变c.823G＞C（GGT＞CGT），p.G275R。此外，还发现IVS16 ds（+129）T＞G，IVS24 as（-31）T＞C，IVS28 as（-14）T＞C，IVS36 as（-18）C＞G，IVS44 ds（+31）T＞C 等多个变异位点。 经查HGMD数据库和相关文献，确认其中的c.823G＞C/p.G275R突变为真正引起成骨不全IV型的致病性突变[5]。应用Chromas软件比对正常对照者和患儿的COL1A1基因Exon 12的正向测序结果如图2所示。

3 讨论

成骨不全IV型（OI-IV）是一种以骨脆弱、蓝巩膜、中度骨骼畸形为典型特征的、罕见的遗传性骨病，具有广泛的表型异质性[6]。患儿通常走路晚，一般多在骨折后才就医，严重的在婴儿期即可发生骨折如本例，轻的到三十多岁都没有骨折发生[7]。IV型的致病基因和 I、II、III型相同，都是 COL1A1、COL1A2 基因，遗传方式也都是AD遗传。由于它的临床症状和其他类型OI以及其他骨病有诸多相似之处，X线和B超检查结果也颇为接近，故临床诊断、影像学检查和系谱分析只能初诊。另外，由于它们都是基因病（为单基因病）、分子病（即不是酶蛋白病），所以常规的染色体核型分析和生化酶学检查也无法诊断。确诊只能靠相关基因的分子遗传学检测。但由于这两个基因结构复杂，外显子加在一起多达103个，又没有突变热点[7]，因此基因诊断颇为费时、费力、费钱。目前，主要是根据PCR条件相同的exons进行分组扩增、测序。为了尽可能减少开支，缩短检查时间，进行基因诊断前有必要对各型进行大致的鉴别诊断。比如先天性OI与迟发性OI之间，迟发性OI与软骨发育不全（ACH）之间，先天性OI与致死性侏儒症（TD）之间都有诸多相似之处，如果盲目检测或全部检测，势必造成经费的浪费和时间的损失。关于这些骨病的快速鉴别诊断可参见我室近期即将发表的相关文献。

Marini等[5]（2007）报道，多数的 OI都是由COL1A1 基因突变所引起，且甘氨酸替换是COL1A 1基因最常见的突变，如本文所报道的p.G275R（甘氨酸→精氨酸）突变正是如此。另外，“甘氨酸→精氨酸”突变所引起的症状要比“甘氨酸→丝氨酸”或“甘氨酸→半胱氨酸”来得严重[7]，本例患儿出生2个月即发生骨折也印证了这一点。

本文发现的p.G275R错义突变，虽然国外已有报道并已确诊为OI-IV型，但国内至今还未见报道，可能跟病例罕见、开展本病基因研究的机构少有关。本例患儿的家族无类似患者，父母非近亲婚配，表型也完全正常，推测可能是母亲在孕期服了药或接触了某种致变因素导致COL1A1基因发生突变并传递给了胎儿造成的。

目前，对于非致死的OI来说，可以通过外科手术、康复疗法及药物对症治疗来缓解病情，或者通过骨髓移植来治疗，但后者费用高昂且有相当风险。因此，目前最为有效也是最佳的应对策略就是对先证患儿进行基因诊断，检出突变，查清病因，然后对有家族史的或者经超声检查疑似怀有OI患胎的高危孕妇进行产前基因诊断，一旦查出患胎，即终止妊娠，这样才能从根源上防止该病的发生，也才能真正实现优生。

[1] 艾阳, 唐佳, 方群, 等. 一例成骨不全II型高危胎儿的产前基因诊断[J]. 中华临床医师杂志: 电子版, 2011, 5(22):6662-6666.

[2] Van Dijk F S, Pals G, Van Rijn R R, et al. Classification of osteogenesis imperfecta revisited[J]. Eur J Med Genet, 2010,53 (1): 1-5.

[3] 唐佳, 潘敬新, 蒋玮莹, 等. 一例抗维生素D佝偻病的基因诊断和新突变的致病性鉴定[J]. 中华临床医师杂志: 电子版,2012, 6(5): 1226-1230.

[4] 王卓, 徐栋梁, 胡俊勇, 等. 成骨不全一家系的COL1A1基因突变分析[J]. 中华医学遗传学杂志, 2006, 23(2): 192-194.

[5] Marini J C, Forlino A, Cabral W A, et al. Consortium for osteogeneslis imperfecta mutations in the helical domain of type I collagen: regions rich in lethal mutations align with collagen binding sites for integrins and proteoglycans[J].Hum Mutat, 2007, 28(3): 209-221.

[6] Glorieux F H. Osteogenesis imperfecta[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2008, 22(1): 85-100.

[7] Cui Y X, Xia X Y, Shi Y C, et al. A G560S mutation in alpha1(I) collagen causes familial osteogenesis imperfecta type IV[J]. Clin Chim Acta, 2009, 409(1-2): 145-146.