韶关市1190例手足口病病原体检测结果分析

2013-07-18马占忠黄文波何凤屏谢秀萍郭艳乐刘玉兰

分子诊断与治疗杂志 2013年1期

马占忠黄文波何凤屏谢秀萍郭艳乐刘玉兰

•论著•

马占忠1★黄文波2何凤屏1谢秀萍1郭艳乐1刘玉兰1

目的分析韶关地区手足口病病原体分布情况。方法收集2011年1月～12月的1190例手足口病患者的咽拭子，采用实时荧光PCR方法检测肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）。结果在1190份标本中病毒核酸阳性率为11.51%（137/1190），其中EV71占60.58%（83/137），CoxA16占39.42%（54/137）；6月份高发，占29.08%（346/1190）；男女比例为1.64:1，且0～4岁的患儿占93.11%。结论韶关地区2011年手足口病病原体以EV71为主，6月份高发，主要分布在0～4岁，男性多于女性，实时荧光PCR可用于手足口病病原体的检测，对手足口病的诊疗和防控具有重要意义。

手足口病；肠道病毒71型；柯萨奇病毒A组16型

手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）是有多种肠道病毒感染引起的常见传染病，主要病原体为肠道病毒71型（Enterovirus71, EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxsackievirusA16, CoxA16）[1]。以手、足、口腔等部位出现斑丘疹、疱疹为主要临床症状。少数患儿可引起脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，会导致死亡。我们采用实时荧光PCR对手足口病患者的咽拭子标本进行检测，分析手足口病病原体分布特点，对手足口病的监测及防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 2011年1月～12月粤北人民医院就诊的1190例临床诊断为手足口病患者的咽拭子标本。临床诊断标准参见卫生部印发的《手足口病诊疗指南》[2]( 2010年版) 。

仪器：实时荧光PCR仪、生物安全柜、高速离心机、干式恒温器。

试剂：EV71和CoxA16检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）。

1.2 方法（参照EV71和CoxA16检测试剂盒说明书）

1.2.1 样本处理与RNA提取

收集的咽拭子标本加入200 µL的生理盐水充分振荡后离心，去掉部分上层液体直至剩余100 µL，吸打混匀放置于1.5 mL灭菌离心管，加入200 µL Trizol试剂及100 µL氯仿，用振荡器振荡20 s后静置3 min，然后12000 rpm离心2 min；小心吸取无色上层液体，转移至新灭菌的1.5 mL离心管，然后加入10 µL RNA提取液A，再用振荡器充分混匀，8000 rpm离心1 min后，小心弃去所有液体；加入溶液C 400 µL，充分振荡混匀，8000 rpm离心1 min，尽可能将液体去除干净；将装有沉淀的离心管于加热器中，60℃干燥5 min，待沉淀物完全烤干，然后加入30 µL DEPC H2O，吸打混匀管中沉淀，得到白色的悬浊液，可直接用于检测，也可存于-70℃待用。

1.2.2 PCR扩增

反应体系：RT-PCR反应液15 µL、逆转录酶2 µL、Taq酶3 µL；上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测样品混浊液、阳性质控品各5 µL，3000 rpm离心30 s，放入PCR扩增仪。反应条件：40℃ 25 min，1个循环；94℃ 3 min，1个循环；93℃ 15 s，55℃ 45 s，40个循环。

1.2.3 结果判断

阴性质控品：无典型S型扩增曲线或无Ct值；阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30；如果检测结果无典型S型扩增曲线或Ct值＞ 35.1，则判断标本为阴性；如果检测结果呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1，则判断标本为阳性。

2 结果

2011年粤北人民医院临床诊断手足口病有1190例，检测出病毒核酸137例，其中EV71核酸阳性占60.58%（83/137），CoxA16占39.42%（54/137）。 6月份高发期，占29.08%（346/1190）（见表1），患者主要分布在0～4岁，占93.11%（1108/1190）（见表2），男性739例，女性451例，男女比例为1.64:1，男性多于女性（见表3）。

3 讨论

本次对韶关市2011年手足口病病原体进行检测分析，发现以EV71感染为主，主要集中在4岁以下儿童，且男性多于女性，高发期在6月份，11月份发病率较高可能是由于韶关市2011年11月气温骤降，儿童免疫力较弱而容易感染。目前检测手足口病病原体有核酸检测、病毒分离和抗体检测等方法。病毒分离检测时间长、操作繁琐、不能同时检测大量标本；ELISA法检测抗体经济快速，但由于病毒感染到抗体出现需要一段时间，且需要急性期与恢复期双份血清，用于疾病的早期诊断灵敏度不高[3]；荧光定量PCR能快速灵敏的检测手足口病病原体的特异性核酸，是手足口病流行期间大批量标本检测的首选方法。

[1]倪语星, 尚红, 等. 临床微生物学与检验[M]. 第4版. 北京:人民卫生出版社, 2009: 436-437.

[2]中华人民共和国卫生部. 手足口病诊疗指南(2010年版)[J].国际呼吸杂志, 2010, 30(24): 1473-1475.

[3]乔凤娇, 刘红, 刘汉芬. 实时荧光PCR技术检测手足口病EV71与CA16病毒核酸[J]. 中国卫生工程学, 2011, 10(3): 253.

Analysis and pathogenic diagnosis of 1190 hand-foot-mouth disease in Shaoguan

MA Zhanzhong1★, HUANG Wenbo2, HE Fengping1, XIE Xiuping1, GUO Yanle1, LIU Yulan1
(1.Department of Clincal Laboratory, Yuebei People's Hospital of Shantou University Medical College, Guangdong, Shaoguan 512026; 2.Shaoguan Medical College, Guangdong, Shaoguan 512026)

Objective To analyze the pathogenic diagnosis of the hand-foot-mouth disease (HFMD) in the city of Shaoguan. Methods Throat swab of 1190 HFMD patients were collected from January to December in 2011. Real-time PCR was used to detect enterovirus71 (EV71) and CoxsackievirusA16 (CoxA16).

Results The positive rate of the virus nucleic acid was 11.51%(137/1190), EV71 was 60.58%(83/137) , CoxA16 was 39.42%(54/137). The peak of HFMD infection ratio was 29.08%（346/1190）in June. Male to female ratio was 1.64:1, 0～4 years old children accounted for 93.11%. Conclusions HFMD was mainly caused by EV71 in Shaoguan 2011. The peak of HFMD was in June and mainly distributed in 0～4 years old children. Male more than female. Real-time PCR can be used to pathogenic diagnosis of HFMD, which plays an important role in diagnosis, treatment, prevention and control of HFMD.

Hand-foot-mouth disease; Enterovirus71; CoxsackievirusA16