慢性HBV感染者血浆循环DNA水平相关因素的研究

赵召霞吕晓峰卢建华潘世扬侯军良夏文颖戴二黑★

•论 著•

慢性HBV感染者血浆循环DNA水平相关因素的研究

赵召霞1吕晓峰2卢建华1潘世扬3侯军良1夏文颖3戴二黑1★

目的探讨影响慢性HBV感染者血浆循环DNA水平变化的相关因素。方法选择145例慢性HBV感染者作为研究对象，其中慢性乙型肝炎轻度30例、中度30例、重度25例；乙肝后肝硬化30例；肝癌30例。选择30例健康体检者作为对照组。采用双重荧光定量PCR法检测血浆中循环DNA的含量。结果随着慢性乙型肝炎病情加重，外周循环DNA水平逐渐升高，但在肝硬化组循环DNA水平反而降低，肝癌组又显著升高，组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。在115例慢性HBV感染者中HBeAg阳性79例，HBeAg阴性36例，HBeAg阳性患者外周循环DNA水平（68.79±14.23 ng/mL）显著高于HBeAg阴性患者（23.68±12.56 ng/mL）（t=2.162, P=0.032）；慢性HBV感染者外周循环DNA水平与ALT和AST水平呈显著正相关，r值分别为0.612和0.632，P值分别为0.014和0.021，但与血清HBV DNA无相关性（P＞0.05）。结论慢性HBV感染者外周循环DNA水平与病毒复制无关，但可反映肝细胞的炎症坏死程度。

循环DNA；肝炎；乙型；慢性；聚合酶链反应

循环DNA的研究主要有定性和定量研究，前者主要检测血清或血浆中各种肿瘤特异性基因的改变，目前的研究甚多；后者检测则以血循环DNA总量为指标，是人体健康评判的重要指标，其量的改变与多种疾病（包括肿瘤、严重外伤、感染性疾病和器官移植等）关系密切。慢性HBV感染者最初主要发生肝脏的炎性反应和坏死，随着疾病发展为肝硬化甚至肝癌，在这过程中其循环DNA的量也会发生相应的改变。本研究旨在探讨慢性HBV感染者血浆循环DNA水平变化的相关因素，为慢性HBV感染者病程中不同阶段的诊断和治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 临床资料

145例慢性HBV感染者系2008年10月～2009年12月肝病科住院患者，男97例，女48例。年龄18～56（27±15）岁。其中慢性乙型肝炎轻度30例，中度30例，重度25例，乙肝后肝硬化30例，肝癌30例。诊断标准依据2005年中华医学会肝病学分会与感染病学分会联合制定的“慢性乙型肝炎防治指南”[1]，所有肝癌患者均经病理证实。所有患者均排除合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎。同时选择30例健康体检者作为正常对照组，其中男15例，女15例。年龄17～46（29±11）岁。

1.2 检测方法

1.2.1 血浆标本的采集和保存：晨起采集空腹静脉血5 mL EDTA抗凝，3000 r/min离心 ，吸取上清于1.5 mL离心管中，再16 000 r/min离心10 min，吸取上层无细胞血浆200 µL,置于含有5.0×104拷贝重组质粒0.2 mL离心管（江苏省人民医院潘世扬教授馈赠）中，充分混匀后-20℃保存备用。

1.2.2 血浆循环DNA的提取：采用磁珠法对血浆DNA和重组质粒同步提取，试剂盒由上海浩源生物科技有限公司提供。

1.2.3 荧光定量PCR检测血浆循环DNA：采用双重荧光定量PCR检测提取的血浆DNA，试剂盒由江苏省人民医院潘世扬教授馈赠。

1.2.4 血清ALT、AST和HBV标志物的检测：采用雅培C8000全自动生化分析仪检测血清ALT和AST。采用ELISA法检测乙肝五项，试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供。采用ABI7300核酸扩增仪检测HBV DNA，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.3 统计学方法

应用SPSS13.0统计学软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用成组设计t检验；相关性采用Pearson直线相关分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性HBV感染者外周循环DNA和转氨酶水平的比较

随着慢性乙型肝炎病情加重，外周循环DNA水平逐渐升高，但在肝硬化组循环DNA水平反而降低，肝癌组又显著升高，组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。转氨酶的变化在病情加重时逐渐升高，肝硬化时降低，肝癌组显著升高，组间差异具有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

2.2 慢性HBV感染者循环DNA与血清HBeAg的关系

在115例慢性HBV感染者中HBeAg阳性79例，HBeAg阴性36例，HBeAg阳性患者外周循环DNA水平（68.79±14.23 ng/mL）显著高于HBeAg阴性患者（23.68±12.56 ng/mL），见表2。

2.3 慢性HBV感染者循环DNA与血清HBV DNA相关性分析

慢性HBV感染者HBV DNA与外周循环DNA无相关性（P=0.061）。

表1 慢性HBV感染者外周循环DNA和转氨酶水平的比较Table 1 Changes of circulating DNA and alanine aminotransferase in patients with chronic HBV infection

表2 慢性HBV感染者循环DNA与血清HBeAg的关系Table 2 The relationship between circulating DNA and serumHBeAg in chronic HBV infection patients

2.4 慢性HBV感染者循环DNA与ALT和AST相关性分析

慢性HBV感染者循环DNA水平与ALT和AST呈显著正相关，r值分别为0.612和0.632，P值分别为0.014和0.021。

3 讨论

循环DNA是存在于人体液中的游离状态的核酸，生理情况下体内游离循环DNA主要由少量衰老死亡细胞释放所产生，其生成和清除处于动态平衡，维持在较恒定的低水平[2]。病理情况下当组织细胞受到来自外源的刺激后主动分泌或者细胞损伤、死亡后产生。随着研究的不断深入，人们发现循环DNA与很多疾病的发展密切相关，尤其是与肿瘤的发生发展有着密切的关系[3]。本文研究结果显示随着慢性乙型肝炎患者病情加重，外周循环DNA水平逐渐升高，慢性乙型肝炎重度组外周循环DNA含量显著高于对照组，说明外周循环DNA可在一定程度上反映肝脏的炎症坏死程度。当肝细胞炎性反应轻微，坏死的肝细胞较少时，释放至外周循环DNA也少，随着病情的加重，肝细胞炎症坏死增加，释放到外周的循环DNA会明显增加，这一结果也与陈进步等[4]人研究结果一致。肝硬化患者外周循环DNA较慢性乙型肝炎重度组显著降低，可能由于肝硬化时大量的肝细胞已经被破坏，肝组织被大量纤维组织取代，产生和释放的循环DNA量减少。肝癌患者循环DNA水平显著高于慢性乙肝患者，这一结果与屠红等[5]研究结果一致，肝癌患者外周循环DNA除了来源于肿瘤组织坏死释放游离DNA进入血液循环外，更主要的是来源于肿瘤细胞分泌和释放的核酸。

研究结果显示慢性HBV感染者HBeAg阳性组外周循环DNA水平显著高于HBeAg阴性组，其原因可能是HBeAg不仅是HBV复制的指标之一，同时HBeAg也是一种免疫调节因子[6]。血清中大量的HBeAg能刺激不同的细胞亚群，使机体针对HBV的免疫应答增强，免疫应答增强的结果之一是肝细胞的变性坏死增多，释放至外周的循环DNA也相应增加。但是，慢性HBV感染者外周循环DNA与HBV DNA水平无相关性，血清中HBV DNA在一定程度上代表的是病毒血症，即反映病毒复制的水平，通常HBV并不直接导致肝脏的细胞病变[7]，因而循环DNA与病毒的复制水平无直接的相关性。

临床上观察肝功能的敏感指标是血清ALT和AST，当肝细胞被破坏，细胞膜通透性增大时ALT升高，当线粒体损伤时AST增高，ALT和AST升高都提示肝细胞受破坏。本研究结果显示外周循环DNA与ALT、AST呈正相关，而且随着慢性乙型肝炎患者病情加重，外周循环DNA水平逐渐升高。因此，循环DNA的变化亦能反映肝细胞坏死损伤的严重程度。

本研究结果提示外周循环DNA的含量与HBV复制无相关性，但在一定程度上能反映肝细胞的炎症坏死程度，即随着慢性乙型肝炎由轻度向重度进展，循环DNA水平也在逐渐升高。但是，随着病情迁延不愈，在肝硬化时循环DNA水平有一个降低的拐点，而发生肝癌时循环DNA水平再次显著升高，且升高幅度非常大，显著高于慢性乙肝患者，包括慢乙肝重度患者。因此，有必要深入研究循环DNA是否可作为肝癌的标志物之一。

[1]中华医学会肝病学分会, 中华医学会传染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中华传染病杂志, 2005, 23(6): 421-431.

[2]潘世扬, 王俊宏. 循环DNA的临床应用研究进展[J]. 齐鲁医学检验, 2004, 15(3): 1-2.

[3]孙群, 王德先. 游离DNA与临床肿瘤的研究进展[J]. 医学综述, 2010, 16(9): 1348-1350.

[4]陈进步, 潘世扬, 周镇先, 等. 血浆DNA定量用于重症肝炎患者肝细胞损伤评估[J]. 临床检验杂志, 2009, 27(2): 112-114.

[5]屠红, 高海峰, 傅士龙, 等. 肿瘤患者循环DNA的定量研究[J]. 中华肿瘤杂志, 2004, 26(10): 606-608.

[6]Asahina Y, Izumi N, Uchihara M, et al. Core promoter/ pre-core mutations are associated with almivudine-induced HBeAg loss chronic hepatitis B with genotype C[J]. J Hepatol, 2003, 39(6): 1063-1069.

[7]刘宝芳, 席志宾. 各型乙型肝炎患者血液HBV DNA水平与临床的关系[J]. 中华肝脏病杂志, 2002, 10(1): 65-66.

Study on the related factors of circulating DNA level in patients with chronic HBV infection

ZHAO Zhaoxia1, LV Xiaofeng2, LU Jianhua1, PAN Shiyang3, HOU Junliang1, XIA Wenying3, DAI Erhei1★
(1.Department of Laboratory, the Fifth Hospital of Shijiazhuang, Hebei, Shijiazhuang 050021, China; 2.Department of Hepatology, the People Hospital of Xingtai, Hebei, Xingtai 054031, China; 3.Department of Laboratory, the People Hospital of Jiangsu, Jiangsu, Nanjin 210029, China)

ObjectiveTo explore the related factors of circulating DNA level in patients with chronic HBV infection. Methods One hundred and forty-five patients with chronic HBV infection were enrolled in the study, including 30 cases with mild chronic hepatitis B, 30 cases with moderate chronic hepatitis B, 25 cases with severe chronic hepatitis B, 30 cases with HBV-induced liver cirrhosis, 30 cases with hepatocarcinoma. Thirty healthy persons were also enrolled as control. The level of plasma circular DNA was detected by duplex real-time polymerase chain reaction assay. Results As the condition of patients with chronic hepatitis B exacerbated, the level of circulating DNA increased gradually，but it reduced in patients with HBV-induced liver cirrhosis, then increased significantly in patients with hepatocarcinoma. There were significant differences among groups(P＜0.05). The level of circulating DNA in plasma HBeAg positive group(68.79±14.23 ng/mL) was significantly higher than that of HBeAg negative group(23.68±12.56 ng/mL)(t=2.162, P=0.032).There was a significantly positive relationship between circulating DNA and alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase (r=0.612; 0.632，P=0.014; 0.021). There was no relationship between circulating DNA and HBV DNA in serum(P＞ 0.05). Conclusion The level of circulating DNA in patients with chronic HBV infection had no relationship with viral replication, but reflects the degree of hepatocyte inflammatory necrosis.

Circulating DNA; Hepatitis, Type B, Chronic; Polymerase chain reaction

河北省卫生厅指令性课题（No.8189）；江苏省实验诊断学重点实验室重大课题（No.XK200731）

1.石家庄市第五医院检验科，河北，石家庄 050021 2.邢台市人民医院肝病科，河北，邢台 054031 3.江苏省人民医院检验科，江苏，南京 210029

★通讯作者：戴二黑，E-mail:daieh2008@yahoo.com.cn