2型神经纤维瘤病标本库的建立及应用分析

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•论 著•

2型神经纤维瘤病标本库的建立及应用分析

赵赋1张晶1王振民2渠沛然2杨智君2王博2刘丕楠1,2★

目的初步建立2型神经纤维瘤病（NF2）患者的标本库，分析其临床应用及遗传学研究的价值。方法收集NF2患者病例资料并进行长期跟踪随访，绘制家族系谱图并建立信息资料库；采集NF2患者及家族高危成员外周静脉血，分离血浆、血清及淋巴细胞分别保存；术中获取新鲜肿瘤组织15 min内存入液氮中，部分组织制作成石蜡标本；提取肿瘤及淋巴细胞标本中的DNA，质检并保存，采用PCR-DNA测序方法进行NF2基因突变分析。结果已将293例患者信息纳入资料库，并完成定期随访；收集肿瘤冰冻标本72例，肿瘤石蜡标本275例，血液样本80例；外周血及冰冻肿瘤组织提取DNA的OD260/280值在1.80～1.86之间，198例石蜡样本提取的DNA片段长度主要分布在1700～2500 bp之间，能满足分子遗传学研究的需要。结论NF2标本库的建立可为症状前基因筛查、遗传规律分析及发病机制研究提供标本来源。

2型神经纤维瘤病；标本库；分子遗传学

2型神经纤维瘤病（neurofibromatosis 2，NF2）是一种常染色体显性遗传病，主要表现为以中枢神经系统肿瘤为主的全身多发肿瘤综合征，临床治疗困难[1]。随着我院临床就诊患者数量的不断增加，迫切需要建立完善的标本库，为NF2早期筛查、临床治疗及发病机制的研究提供资料和标本。因此，本文将探讨如何建立NF2标本库，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 标本来源

收集2000年1月至2008年4月间，北京天坛医院和北京市神经外科研究所治疗的NF2患者病例资料和肿瘤石蜡标本；自2008年5月至今，采集北京天坛医院诊治NF2患者的临床资料、肿瘤和血液样本，以及家庭高危成员的信息资料和血液样本。

1.2 主要设备和试剂

液氮储存罐（Cryosystem 4000，美国MVE）；-80℃低温冰箱（MDF-U4186S，日本三洋）；高速台式冷冻型离心机（Primo R，德国Heraeus）；L500低速自动平衡离心机（北京京立离心机仪器有限公司）；紫外分光光度仪（Pharmacia Biotech Uhrospec 3000）；安捷伦2100生物分析仪（Agilent 2100 DNA 7500，美国安捷伦科技有限公司）；红细胞裂解液购自北京塞驰生物科技有限公司；Promega公司的基因组DNA 纯化试剂盒（Wizard®Genomic DNA Purification Kit）和石蜡样本基因组DNA小提系统（ReliaPrep™ FFPE gDNAMiniprep System）。

1.3 标本取材和保存方法

1.3.1 血液标本的采集、处理及保存

采血前征得患者同意，签署标本采集知情同意书。真空采血管采集10 mL外周静脉血，其中6 mL为EDTA抗凝，4 mL不抗凝。非抗凝血室温静置 后，3000 r/min离心5 min，吸取上层血清分装入离心管中。抗凝管采血后颠倒混匀3次，室温静置30 min后，3000 r/min离心5 min，吸取上层血浆分装入离心管中；下层细胞沉淀移至15 mL离心管内，加入10～12 mL红细胞裂解液，室温孵育10 min，1000 r/min离心10 min，弃上层红色清液。用生理盐水轻轻吹打冲洗所留取沉淀物3次，1000 r/min离心3 min，弃去上清液，重复2～3遍，收集白色沉淀即为淋巴细胞。全部操作均在无菌条件下进行，血清和血浆保存于-80℃冰箱内，淋巴细胞保存于液氮内。

1.3.2 新鲜肿瘤标本的采集与保存

手术过程中获取新鲜肿瘤组织，在无菌条件下取无烧灼、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水将血液冲洗干净后，取1/3肿瘤组织修剪成直径为0.5 cm小块3～5份，放入带标签的冻存管中，新鲜组织需在离体后15 min内放入液氮内。其余2/3放入3.8%多聚甲醛固定液用于病理检查。

1.3.3 石蜡标本的采集

标本经固定后常规取材、脱水、包埋，制作成石蜡标本，对其进行切片、HE及免疫组化染色，确定肿瘤组织性质。详细记录病理学结果，取剩余样本制作成石蜡标本保存于标本库中。

1.3.4 DNA的纯化与保存

取部分裂解后淋巴细胞，用涡旋振荡器剧烈混匀直至重悬；冰冻肿瘤组织用研钵研槌研磨，待液氮挥发后取10～20 mg肿瘤组织，采用Promega公司Wizard®Genomic DNA Purification Kit试剂盒淋巴细胞及冰冻组织提取基因组DNA说明提取上述基因组DNA。取10～20 mg石蜡组织切片，采用FFPE gDNA小提系统常规脱蜡后提取组织DNA。取1μL样本用分光光度计进行DNA纯度鉴定，并用Aglient2100生物分析仪检测DNA的完整性，所有提取DNA均保存在-20℃冰箱中。

1.4 资料信息化管理

将患者病历资料、随访记录、遗传学信息及标本存放等四部分内容进行信息化管理。①自行设计和开发一套资料管理操作系统应用于病历资料管理，病历资料包括：基本信息表、病史特点、影像学特点以及家族史等内容；②随访记录包括：患者病情进展、长期治疗经过、复查症状和体征变化等信息，同时建立家庭高危成员长期随访记录表，以便在其症状出现前进行临床干预；③遗传学信息包括：患者NF2基因突变类型和位点，相关家庭高危成员进行基因检测的筛查结果，并绘制家族系谱图；④标本按家系分别存放，存放信息包括：患者入库编号、入库时间、标本类型及数量、存放位置等。

1.5 分析方法

采用Primer 6.0设计引物并用PCR仪进行扩增，产物DNA经回收纯化，用DNA分析仪进行双向测序，对22q12上NF2基因序列进行测序分析。

2 结果

已收集和整理386例NF2病例资料，其中门诊或电话跟踪随访293例，建立随访记录并纳入患者信息库。信息库中包括男性156例，女性137例，患者发病年龄在7～71岁之间，平均为30.5岁；家族遗传性患者76例，相关家庭高危成员103例，其中10岁以下儿童42例，上述患者均绘制家族系谱图（图1）。

图1 一例三代家族遗传性NF2患者的家族系谱图Figure 1 Family tree of inherited patients of NF2

目前，已保存各类肿瘤石蜡标本275例、冰冻标本72例，患者外周血液标本80例，制定合理的标本采集流程规范，初步建立起包含血清、血浆及淋巴细胞标本、冰冻及石蜡肿瘤标本和DNA标本的NF2肿瘤标本库。从血液、冰冻组织样本中提取DNA并进行质检，OD260/280比值分别为1.85和1.80～1.86之间；198例石蜡样本DNA片段长度主要分布在1700～2500 bp之间（图2）。

对标本库保存的样本进行NF2基因的测序，包括27例石蜡标本、15例冰冻标本和12例血液样本，在外显子序列中共发现出51个位点发生突变，5例散发患者存在体细胞镶嵌现象（图3）；对14例家庭高危成员血液标本进行筛查，6例发现遗传位点存在基因突变（图4）。结果显示：标本库采集并存放的各类样本，可进一步用于NF2相关的分子遗传学研究。

3 讨论

随着分子生物学技术的不断提高，使得人们对肿瘤的发生和发展能有更深入的认识。而建立完善的标本库能更规范和高效地利用肿瘤标本，从而进行多个领域的研究。对于NF2这类少见的遗传性疾病来说，进行基因水平的研究，不仅可揭示肿瘤的形成机制和相关功能基因特征，而且可用以指导疾病早期诊断及靶向治疗。目前已明确NF2是由常染色体22q12上的NF2抑癌基因突变引起的，其编码的Merlin蛋白功能异常或缺乏时将引起肿瘤生长。但NF2基因突变的规律及Merlin蛋白的功能尚未得以完全阐明[2]，且疾病相关研究的进展缓慢。原因可能是由于NF2发病率低且分布散在，未能形成大规模的病例资料统计和完善的肿瘤标本库造成的。目前，全世界仅英国曼彻斯特的圣玛丽医院建立了较大规模的NF2标本库，并据此开展了一系列研究[3]。由于NF2突变可能因种族或地域的不同存在一定的差异性，因此，建立我国NF2患者的标本库，将为研究NF2发生机理和遗传规律起到重要作用。此外，在散发的听神经瘤、脑膜瘤和室管膜瘤中也发现存在NF2基因突变[4]，采集肿瘤标本也将有助于进一步揭示NF2基因在脑肿瘤中的作用机制。

图2 石蜡标本DNA质检结果Figure 2 DNA quality control results of FFPE samples

图3 一例散发NF2患者测序图Figure 3 Sequencing results of a sporadic patient of NF2

图4 一例家系遗传NF2患者的DNA测序图Figure 4 Sequencing results of a inherited patient of NF2

由于NF2为常染色体显性遗传病，患者约有50%的概率将突变传给下一代。随着诊断及治疗水平的不断提高，我国将有越来越多的患者得到及时地治疗，患者年龄也将更加年轻化。但NF2发病方式多样化，目前确诊标准仍以临床表现为依据，不能进行有效地早期干预。因此，开展基因学分析特别是针对家族性病例，能更有效地开展治疗和指导性服务，包括治疗方案的确立、早期家庭的临床护理、计划生育咨询和产前诊断等。当受累患者确定存在某个突变时，应采集家庭高危成员的血液标本，提取DNA并进行NF2基因突变检测。可采用基因测序技术联合多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA），对NF2基因所有外显子进行基因序列分析，其检测的敏感度达91～95%[5]。由于新发的NF2患者可能存在体细胞镶嵌现象，可将血液及肿瘤样本共同检测，才能更好的确定突变。对于儿童进行症状前检测的最佳时机仍存在争议[6]，但尽早确诊能让患者及家庭成员做好各方面准备，从而进行疾病的监测和治疗。家族遗传的病例应详细绘制家族系谱图，并以家系为单位存放资料和各个标本，为NF2遗传规律的研究和长期家庭治疗打下基础。

要建立一个符合国际标准的NF2肿瘤标本库，规范化的标本采集、保存及使用是必要的，应由专人负责管理和登记。由于NF2患者都需要接受多次治疗，应详细记录治疗经过并建立完善的信息资料库，为后续治疗提供指导和帮助。如果患者选择在当地医疗机构进行手术治疗，通常不能获取高质量的冻存组织标本，石蜡标本同样可以作为较好的研究对象。石蜡样本提取DNA的质量能够较好地满足PCR反应和基因测序要求，有研究显示[7]石蜡样本可用于开展芯片技术和RNA的分析。标本的良好运用也将为临床治疗提供更多新的思路，Plotkin报道了[8]根据NF2听神经鞘瘤石蜡样本免疫组化结果，尝试用贝伐单抗进行药物治疗，有效地减小了听神经瘤体积。因此，在建立NF2完善的肿瘤标本库基础上，应进行合理地开发和利用，有望尽早发现在基因水平上阻断NF2肿瘤发生的新方法。

[1]Baser M E, Kuramoto L, Joe H, et al. Genotype-phenotype correlations for nervous system tumors in neurofibromatosis 2: a population-based study[J]. Am J Hum Genet, 2004, 75(2): 231-239.

[2]Rouleau G A, Merel P, Lutchman M, et al. Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neuro-fibromatosis type 2[J]. Nature, 1993, 363(6429): 515-521.

[3]Evans D G R, Moran A, King A, et al. Incidence of vestibular schwannoma and neuro-fibromatosis 2 in the North West of England over a 10 year period higher incidence than previously thought[J]. Otol Neurotol, 2005, 26(1): 93-97.

[4]Begnmi M D, Palau M, Rushing E J, et al. Evaluation of NF2 gene deletion in sporadic schwannomas, meningiomas, and ependymomas by chromogenic in situ hybridization[J]. Hum Pathol, 2007, 38(9): 1345-1350.

[5]Evans D G R, Baser M E, O'Reilly B, et al. Management of the patient and family with neurofibromatosis 2: a consensus conference statement[J]. Br J Neurosurg, 2005, 19(1): 5-12.

[6]Twomey J G, Bove C, Cassidy D. Presymptomatic genetic testing in children for neurofibromatosis 2[J]. J Pediatr Nurs, 2008, 23(3): 183-194.

[7]Abramovitz M, Ordanic-Kodani M, Wang Y, et al. Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay[J]. Biotechniques, 2008, 44(3): 417-423.

[8]Plotkin S R, Stemmer-Rachamimov A O, Barker F G, et al. Hearing improvement after bevacizumab in patients with neurofibromatosis type 2[J]. N Engl J Med, 2009, 361(4): 358-367.

Establishment and analysis of neurofibromatosis type 2 bank for research

ZHAO Fu1, ZHANG Jing1, WANG Zhenmin2, QU Peiran2, YANG Zhijun2, WANG Bo2, LIU Pinan1,2★
(1. Beijing Neurosurgical Institute, Affiliated of Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100050, China; 2. Department of Neurosurgery, Beijing Tiantan Hospital, Affiliated of Capital Medical University, Beijing 100050, China)

Objective To establish tissue bank of neurofibromatosis type 2 (NF2) and analysis its scientific value. Methods Medical records and long-term follow-up data of NF2 patients were collected for the establishment of data bank. Blood specimens of patients and high-risk family members of NF2 were taken, and the plasma, serum and lymphocytes were saved separately. Fresh tissues of NF2 tumors were obtained during the surgery and stored in liquid nitrogen, and some parts of tissue were formalin-fixed and parrffinembedded(FFPE). DNA of tumors and lymphocytes were extracted. Multipiex PCR and DNA seguencing were used for gene mutations analysis and screening test. Results 293 cases of NF2 patients, 72 specimens of frozen tissue, 275 specimens of FFPE tissue and 80 samples of blood were collected. OD260/280 ratios of DNA were between 1.80～1.86, and DNA fragments of 198 FFPE samples are between 1700～2500 bp. Both of them could be used for molecular genetic research. Conclusion Establishment of NF2 tissue bank could supply materials and datas for pre-symptomatic genetic screening, analysis of inheritance law and research of pathogenesis.

Neurofibromatosis type 2; Bank; Molecular genetics

国家科技支撑计划课题（2012BAI12B03）；北京市自然科学基金（7112049）；北京市卫生系统高层次卫生技术人才队伍建设专项经费资助

1.中国医学科学院北京市神经外科研究所，北京100050；2.首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京 100050

★通讯作者：刘丕楠，E-mail:liupinan@gmail.com