内皮抑素重组腺病毒治疗肝癌裸鼠模型的实验观察*

龙洪清

(湖北科技学院临床医学院肿瘤学与核医学教研室，湖北咸宁437100)

恶性肿瘤包括肝癌在内的实体瘤主要依赖新血管的生成以及远处转移对机体构成严重危害。因此，针对新生血管生成治疗，是针对包括肝癌在内的恶性肿瘤进行治疗的一个重要策略［1，2］。内皮抑素(Endostatin)对体外内皮细胞增殖具有明显抑制活性，体内亦可特异性抑制内皮细胞增殖和新生血管形成，抑制肿瘤生长。恶性肿瘤治疗方法中基因治疗是近些年研究较热的一种重要方法。如何准确有效将外源基因导入恶性肿瘤细胞，是有效治疗肿瘤的关键技术。病毒载体中腺病毒是被证明最有前途的基因治疗载体。本实验利用已成功构建的内皮抑素重组腺病毒Ad-endostatin［3］，用HUVEC 细胞观察抑制作用，用裸鼠制备HepG2肝癌细胞荷瘤模型，通过瘤内注射Ad-endostatin，了解其对肿瘤血管生成的抑制作用，为临床实施重组基因技术治疗恶性肿瘤提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVEC 细胞，HepG2细胞，购自武汉大学生命科学细胞库;雌性BALB/C 裸鼠，6～8周龄，体质量20g 左右，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法观察Ad-endosatin 对细胞生长的抑制作用

HUVEC 细胞种植于96孔板中，每孔1×104细胞，置于37℃5%CO2孵箱培养过夜。设Ad-Endo 感染组、Ad-EGFP 感染组(Mock 组)和未处理组(PBS 组)。待培养细胞贴壁后再感染细胞。Ad-Endo 感染组分别加入10、50感染复数(MOI)的Ad-Endo 病毒感染1h，换液继续培养，分别于24、48h 后，用无菌枪尖吸去培养液。以完全培养基稀释MTT，终浓度为5mg/ml，每孔加入10μl，将细胞放回5% CO2培养箱中孵育4h，再吸去含MTT 的培养基，每孔加入150μl 二甲亚砜(DMSO)，用酶标仪在490nm 波长处读取吸收值。Ad-EGFP 感染组分别加入10、50MOI Ad-EGFP，方法同Ad-Endo 感染组。以PBS 组的吸收值为100%作对照，检测细胞活性，计算细胞增殖抑制率。

1.2.2 动物模型的建立与治疗作用观察

雌性BALB/C-nu 裸小鼠共15只，作为可移植性肝癌HepG2肿瘤模型宿主。所有裸鼠均饲养于标准无菌隔离小笼。于裸鼠皮下接种约5×106个肿瘤细胞，接种9d 后(肿瘤大小约100mm3)，将小鼠随机分为3组:PBS 对照组、Ad-EGFP 组、Ad-Endo 治疗组，每组小鼠5只。分组后开始进行瘤内注射治疗。治疗组采用Ad-Endo 2×109Pfu/100μl PBS，每隔3d 瘤内多点注射1次;Ad-EGFP 组采用Ad-EGFP 2×109Pfu/100μl PBS，PBS 对照组采用100μl PBS。观察肿瘤体积生长变化。每3d 1次称重小鼠，用游标卡尺测量皮下肿瘤最大经(a)最小经(b)，计算肿瘤体积V=ab2/2，取均值绘制肿瘤体积变化曲线。

1.2.3 肿瘤组织微血管密度观察

治疗21d 后处死小鼠，迅速取出肿瘤组织，10%中性甲醛固定。采用常规ABC 免疫组织化学染色方法，所选一抗为大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体，二抗为生物素标记的兔抗大鼠IgG。肿瘤组织平均血管密度(MVD)以血管内皮细胞CD31抗原表达程度判断。在显微镜下计数6个高倍镜(200倍)视野中CD31阳性细胞数，每个视野平均数为MVD。

1.3 统计分析

实验结果以均数±标准差表示，统计采用SPSS 13.0软件包计算处理。资料差异比较采用t检验。统计学分析均以а=0.05为标准检验水准，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制分析

MTT 法检测HUVEC 细胞感染后的细胞活性。Ad-EGFP 感染组(Mock 组)和未处理组(PBS组)的细胞仅仅出现较弱的非特异细胞增殖抑制。Ad-Endo 感染组明显抑制HUVEC 细胞增殖。当使用10 MOI 的病毒时，感染24、48h 后的细胞活性分别为(87.61±4.59)%、(81.48±3.88)%;当使用50 MOI 的病毒时，感染24、48h 后的细胞活性分别下降到(79.30±3.76)%、(63.75±2.82)%，如图1A。感染复数增加，感染时间延长，细胞活性明显下降，t=3.132，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Ad-Endo 感染组中检测到Endostatin 蛋白在靶细胞中的表达，如图1B 所示。

图1 HUVEC 细胞活性变化

2.2 体内肿瘤治疗实验结果

裸鼠皮下肿瘤组织体积变化，如图2显示，Ad-Endo 治疗组小鼠皮下肿瘤组织均出现了一定的治疗效果，治疗21d 后，PBS 对照组肿瘤体积895±44mm3，Ad-EGFP 组683±33mm3，Ad-Endo治疗组435±26mm3，与PBS 对照组相比，Ad-Endo治疗组肿瘤生长体积抑制率达到51.40%，t=19.819，差异具有显著性(P＜0.001)。

图2 BALB/c 荷瘤裸鼠肿瘤生长体积变化曲线

2.3 肿瘤组织微血管密度检测结果

免疫组织化学检测肿瘤组织切片中的肿瘤微血管生成情况，如图3所示。结果显示在Ad-Endo 治疗组，小鼠肿瘤切片中肿瘤组织微血管生成明显减少，每个高倍镜视野平均CD31阳性细胞数MVD 为68.34±3.29，明显低于Ad-EGFP 组96.06±4.38和PBS 对照组113.28±5.20，t=12.600，差异具有显著性(P＜0.001)。

图3 肿瘤组织切片CD31表达的免疫组化分析

(A)、(B)和(C)分别为用PBS、Ad-EGFP 和Ad-Endo治疗荷瘤小鼠肿瘤组织石蜡切片ABC 法免疫组化染色。在显微镜下观察CD31阳性细胞(棕色)。(200×)

3 讨论

肿瘤新血管的生成为正在生长的肿瘤获得足够的营养和氧气，这对于肿瘤来说非常重要。Folkman 等［4］证明除非有新血管生成，否则肿瘤不可能超过几毫米。血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡控制新血管的生成。目前，已经鉴定了各种不同的血管生成因子和血管生成抑制因子，其中一些血管生成因子或抑制因子通过分子生物技术改造，逐步进入临床试验或临床应用阶段。

内皮抑素(Endostatin)由胶原蛋白XⅧ的羧基末端非胶原区内的184个氨基酸构成，其分子量为20KD，是众多内源性血管形成抑制因子之一，它的出现曾经在生物学界引起巨大轰动。其特点是:①大剂量给药也不引起毒性和不良反应;②每天静脉滴注不同剂量的Endostatin，可见肿瘤内血流和代谢明显下降;③Endostatin 不影响生理性创伤愈合，但可抑制病理性血管形成。有研究表明，将Lewis 肺肿瘤移植到鼠体内，生长至100～200mm3时用Endostatin 进行全身性治疗，能有效地抑制原发肿瘤的生长，剂量愈大，效用愈强。为使肿瘤持续消退并维持于休眠状态，内皮抑素必须长期应用。但是其理化性质活泼，不稳定，易变性;分离提纯过程复杂，大量制备比较困难。因此，制约了其大量生产和广泛应用。然而，基因重组导入治疗技术可以避免大量制备内皮抑素比较困难的难题，为肿瘤治疗提供了新思路和新方法。杨志广等人［5］构建了带有分泌信号的内皮抑素原核表达载体pFLAG-ssEndostatin。于磊等人［6］构建了腺相关病毒(rAAV)-肿瘤内皮抑素(tumstatin)载体rAAV-Tum，体外实验表明该病毒能高效诱导内皮细胞凋亡。笔者［3］成功构建人内皮抑素重组腺病毒Ad-endostatin，实验表明它使HEK293细胞出现明显病变效应。本研究利用已构建成功的重组腺病毒Ad-endostatin，观察其对HUVEC 细胞增殖的抑制作用。实验表明感染复数增加，感染时间延长，抑制作用明显增强。

对恶性肿瘤细胞进行直接杀灭或抑制作用是对肿瘤进行有效治疗的重要方式。王荣等人［7］用带有内皮抑素基因真核细胞表达载体质粒导入裸鼠ACHN 肾细胞癌(RCC)细胞中，结果内皮抑素表达质粒能显著抑制裸鼠ACHN 的RCC 肿瘤体积增长。Li S 等人［8］用人工合成内皮抑素核苷酸序列编码25-31氨基酸，Peptide 30，观察到能够有效抑制HepG2肿瘤细胞黏附、侵袭和迁移。本实验采用重组腺病毒Ad-Endo，瘤内注射治疗HepG2肝癌细胞制备的裸鼠肿瘤模型，采用多时间点注射，对肝癌肿瘤组织生长抑制率达到51.40%。进一步说明内皮抑素对肿瘤细胞生长具有明显抑制作用。机制可能是由于重组腺病毒Ad-Endo 具有感染效率高的特点，能够有效将目的基因转入肿瘤组织细胞中，通过持续表达内皮抑素，对裸鼠皮下接种HepG2肝癌细胞增殖生长具有明显抑制作用，而且作用持久。更可能是与内皮抑素抑制肿瘤组织中血管内皮细胞增殖，促进内皮细胞凋亡有关，使肿瘤细胞营养缺乏数量减少，在总体上表现为肿瘤生长变慢、体积缩小。

CD31是血管内皮细胞的重要标记。Xie L等［9］研究了肿瘤血管生成过程中内生血管生成抑制剂(EAIs)的作用，进一步验证了血管生成平衡假说理论。本实验中，在Ad-Endo 治疗组，用免疫组化染色显示肝癌组织中血管生成明显减少，每6个高倍镜视野中平均CD31阳性细胞数68.34，明显低于Ad-EGFP 组(96.06)和PBS 对照组(113.28)。实验结果说明腺病毒介导的内皮抑素，明显抑制肿瘤模型中肿瘤组织新生血管的生成，打破了血管生成平衡，为进行内皮抑素基因治疗提供了实验依据。

［1］Folkman J.Antiangiogenesis in cancer therapy-endostatin and its mechanisms of action［J］.Exp Cell Res，2006，312:594

［2］Folkman J.Angiogenesis:an organizing principle for drug discovery［J］.Nat Rev Drug Discov，2007，6:273

［3］龙洪清.重组腺病毒Ad-Endostatin 载体构建与表达检测［J］.咸宁学院学报(医学版)，2012，26(2):96

［4］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.New Engl J Med，1971，285:1182

［5］杨志广，刘林林，苏清秀，等.小鼠分泌型内皮抑素原核表达载体pFLAG-ssEndostatin 的构建［J］.中国实验诊断学，2010，14(3):378

［6］于磊，孙岩，雷铭德，等.肿瘤血管内皮抑素tumstatin腺相关病毒载体的构建及其功能的初步鉴定［J］.实用医学杂志，2010，26(7):1100

［7］王荣，曾进，蒋林涛，等.内皮抑素基因对ACHN RCC细胞增殖和凋亡的影响［J］.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2010，2(2):108

［8］Li S，Wei J，Yuan L，et al.RGD-modified endostatin peptide 30 derived from endostatin suppresses invasion and migration of HepG2 cell through the αγβ3 pathway［J］.Cancer Biother Radiopharm.2011，26(5):529

［9］Xie L，Duncan MB，Pahler J，et al.Counterbalancing angiogenic regulatory factors control the rate of cancer progression and survival in a stage-specific manner［J］.Proc Natl Acad Sci USA.2011，108(24):9939