HPLC法测定片剂中双氢青蒿素含量的不确定度评估

朱 凯

(重庆第二师范学院生化系，重庆400067)

药品中有效成分的定量分析是药物质量控制的重要研究领域，其定量分析结果是否准确可靠直接决定了药物的安全性和有效性。传统上判定测量结果是否准确，主要是通过测量误差来表示。近些年，国际标准化组织(ISO)制定了《测量不确定度表达指南》，方法能够更客观、准确的评价测定结果的质量，不确定度是测量的重要质量特性之一［1，2］。在分析测量中，不确定度评价正在成为一种常规要求［3］。不确定度越小，则测量方法水平越高，其测量的结果使用价值越大。测量的不确定度是定量分析结果中重要组成部分之一，可用于评估定量方法是否可靠，测量结果是否可信。双氢青蒿素哌喹片为双氢青蒿素和磷酸哌喹组成的复方片剂，是一种治疗疟疾的优良药物［4，5］。双氢青蒿素及磷酸哌喹均为中国药典(2010年版)收载［6］。对HPLC法测定双氢青蒿素哌喹片中双氢青蒿素含量的不确定度构成进行分析，计算不确定度的大小，为评价HPLC法测定片剂含量的结果、提高测定质量提供科学依据和参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LC-2010A高效液相色谱仪(包括自动进样器)，SPD-M10Avp二极管阵列检测器，CLASS-VP色谱工作站;Mettler AE240电子分析天平。

双氢青蒿素哌喹片(重庆华立控股股份有限公司，每片含双氢青蒿素40 mg、磷酸哌喹0.32 g，批号20050403)，双氢青蒿素对照品(中国药品生物制品检定所，含量100.0%，批号100184-200401)，乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

(1)色谱条件与系统适用性试验。色谱柱为Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈-甲醇 -0.02 mol/L硫酸铵(50∶10∶40，稀硫酸调 pH4.8)，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量10μL。理论板数按双氢青蒿素α异构体峰或β异构体峰计算均不低于10 000。

(2)测定法。取双氢青蒿素哌喹片10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于双氢青蒿素20 mg)，置25 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，振摇5 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，静置30 min，作为供试品溶液;另取双氢青蒿素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.8 mg的溶液，静置30 min，作为对照溶液。精密量取供试品溶液与对照溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以α异构体和β异构体的峰面积之和计算供试品中双氢青蒿素的含量。

2 测量不确定度的分析

2.1 测量不确定度的构成及相对合成标准不确定度的数学表达式

根据HPLC外标法以峰面积计算含量的基本原理，双氢青蒿素哌喹片中双氢青蒿素含量的数学表达式为:

式中，X为双氢青蒿素哌喹片中双氢青蒿素的含量(mg/片)为HPLC法的校正因子(mg/mL)，AX为供试品溶液中双氢青蒿素的峰面积，VX为供试品溶液的体积(mL)为平均片重(g/片)，mX为供试品重(g)。

2.2 不确定度分量的评定

2.2.1 HPLC 法校正因子f的相对标准不确定度urel(f)

2.2.1.1 对照溶液浓度的相对标准不确定度urel(CS)

(1)对照品称量的相对标准不确定度urel(mS)。主要来自天平精度的标准不确定度u1(mS)和天平称量重复性的标准不确定度u2(mS)。

①天平精度的标准不确定度u1(mS)。从天平校准证书查得，所用量程范围内天平的精度为0.01 mg。按矩形分布计算，取包含因子则。

②天平称量重复性的标准不确定度u2(mS)。从天平校准证书查得，所用天平的重复性(标准偏差)为0.02 mg，则 u2(mS)=s(mS)=2 × 10-2mg。

因对照溶液含对照品20.93 mg，故对照品称量的相对标准不确定度为:

(2)对照品纯度的相对标准不确定度urel(P)。由于双氢青蒿素对照品的纯度为100.0%，即分散区间半宽a=0.05%，纯度p=0.999 5±0.000 5。按矩形分布计算，取包含因子则对照品纯度的相对标准不确定度为:

(3)对照溶液体积的相对标准不确定度urel(VS)。主要来自量瓶体积的标准不确定度u1(VS)、定容重复性的标准不确定度u2(VS)和溶液温度与量瓶校正温度不同引起的标准不确定度u3(VS)。

① 量瓶体积的标准不确定度u1(VS)。查表［2］得，A级25 mL量瓶的最大允许误差MPE为 ±0.03 mL。按矩形分布计算，取包含因子，则 u(V)

②定容重复性的标准不确定度u2(VS)。将A级25 mL量瓶用溶液定容，精密称定，重复操作10次，则标准偏差 s(VS)=0.01 mL，故 u2(VS)=s(VS)=0.01 mL。

③溶液温度与量瓶校正温度不同引起的标准不确定度u3(VS)。溶液温度Tt=26℃，量瓶校正温度T0=20℃，查得甲醇和玻璃的体积膨胀系数分别为α醇=1.19 ×10-3和α玻=1.5 ×10-5，故25 mL量瓶因温度不同产生的体积变化［2］ΔV=(α醇-α玻)× V20×(Tt-T0)=(1.19 × 10-3-1.5 × 10-5)× 25 ×(26-20)=0.18 mL。按矩形分布计算，取包含因子，则

故对照溶液体积的相对标准不确定度为:

因此，对照溶液浓度的相对标准不确定度为:

2.2.1.2 对照溶液色谱峰面积的相对标准不确定度urel(AS)

对照溶液连续进样10 次，测得峰面积为:251 638，250 540，249 386，251 880，252 519，251 173，248 497，250 321，251 707，250 892。计算得，均值为250 855，标准偏差 s(AS)=1 219，则 u(AS)=s(AS)=1 219。

测定校正因子f时，对照溶液平行进样6次，测得峰面积为:253 656，253 483，251 628，251 880，252 519和251 707。故对照溶液色谱峰面积的相对标准不确定度为:

2.2.2 供试品溶液色谱峰面积的相对标准不确定度urel(AX)

供试品溶液平行进样2次，测得峰面积为243 799和241 057，均值AX=242 428，极差R=2 742。当平行测定次数 n=2时，查得［7］极差系数 C=1.13，则=2.4 ×103，故供试品溶液色谱峰面积的相对标准不确定度为:

2.2.3 供试品溶液体积的相对标准不确定度urel(VX)

供试品溶液的体积为25 mL。按“2.2.1.1对照溶液体积的相对标准不确定度urel(VS)”项下计算，供试品溶液体积的相对标准不确定度为:

2.2.4 供试品称量的相对标准不确定度urel(mX)

供试品溶液中，供试品重0.265 1 g。按“2.2.1.1对照品称量的相对标准不确定度urel(mS)”项下计算，供试品称量的相对标准不确定度为:

按“2.2.1.1天平精度的标准不确定度u1(mS)”项下计算=5.8 × 10-3mg。

按“2.2.1.1称量重复性的标准不确定度u2(mS)”项下计算)=2 × 10-2mg。

根据中国药典(2010年版)二部附录ⅠA片剂重量差异检查法［6］，取供试品20片，精密称定，每片的重量分别为 0.530 3，0.530 7，0.532 8，0.526 4，0.529 7，0.530 4，0.534 1，0.527 3，0.528 3，0.531 4，0.528 0，0.527 3，0.535 9，0.529 7，0.532 4，0.534 1，0.529 9，0.531 4，0.526 3 g 和0.5264 g。计算得，平均片重0.530 1 g，标准偏差=2.7 mg，则片重差异的标准不确定度为［8］:

因此，供试品平均片重的相对标准不确定度为:

2.3 合成不确定度的评定

根据式(2)，供试品中双氢青蒿素含量测定的相对合成标准不确定度为:

因为双氢青蒿素含量测定结果X=40.1 mg，故合成标准不确定度为:

2.4 扩展不确定度的评定

按95%置信概率，取包含因子k=2，实验扩展不确定度为:

3 结论

根据以上不确定度的评估计算，双氢青蒿素哌喹片中双氢青蒿素的含量测定结果可表示为X±U，即40.1 mg ± 0.8 mg。

HPLC法测定供试品中双氢青蒿素含量的不确定度分量及其权重见表1。

表1 不确定度分量及其权重

从表1可看出，HPLC法测定双氢青蒿素哌喹片中双氢青蒿素含量的不确定度由彼此独立的、m和mX的不确定度分量构成。其中，供试品溶液色谱峰面积AX所引起的不确定度分量对合成不确定度影响最大。

［1］LEITO S，MÖLDER K，KÜNNAPAS，et al.Uncertainty in liquid chromatographic analysis of pharmaceutical product:Influence of various uncertainty sources［J］.Journal of Chromatography A，2006，121(1):55-63

［2］李慎安，王玉莲，范巧成.化学实验室测量不确定度［M］.北京:化学工业出版社，2007

［3］ELLISON SL R，ROSSLEIN M，WILLIAMSA.Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement［M］.Berlin:Eurachem，2000

［4］国家食品药品监督管理局药品标准［S］.WS-899(X-664)-2002

［5］宋建平.双氢青蒿素哌喹复方治疗无并发症恶性疟的临床观察［J］.中华医学杂志，2003，83(12):1099-1100

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:化学工业出版社，2010

［7］国家质量技术监督局.测量不确定度评定与表示［M］.北京:中国计量出版社，1999

［8］王玉，潘晞陵.药品检测中的片剂重量差异不确定度估算［J］.药物分析杂志，2005，25(6):706-708