黄芩苷对神经病理性疼痛模型大鼠机械性痛觉超敏的影响

冀洁 宋华园 戴文玲 周丹丽 韩园 刘文涛

神经病理性疼痛是由神经系统原发或继发性损害或功能障碍所引起的慢性疼痛。其发病机制和有效治疗一直是科研热点和难点。

黄芩是一味传统的清热解毒中药, 其有效成分为黄酮类。黄芩苷是从黄芩中提取并鉴定出的最主要的活性成分之一。药理学实验研究证实［1］黄芩苷具有抗菌, 抗炎, 抗氧化,镇静, 及心血管和脑损伤保护作用等多种药理作用。有研究显示, 黄芩提取物可抑制LPS诱发的小胶质细胞活化并降低炎症因子的释放［2,3］。小胶质细胞的异常活化已被证明在神经病理性疼痛中发挥了重要作用［4］。

黄芩苷对神经病理性疼痛的治疗作用的研究尚未见报道。本研究制备大鼠坐骨神经慢性压迫模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI), 利用Von Frey法考察黄芩苷对神经损伤造成的机械性痛觉超敏的治疗作用。

1 材料

1. 1 药物 黄芩苷, 纯度95%, 购于南京泽朗植提技术有限公司。盐酸吗啡, 购自沈阳第一制药厂。

1. 2 动物 健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠, 体重为180～220 g, 由浙江省实验动物中心提供, 生产许可证号：SCXK(浙 )2008-0033。

1. 3 Von Frey测痛包(美国DanMic Global公司)。

2 方法与结果

2. 1 数据统计 结果均以(±s)表示, 用SPSS 11.5分析软件进行组间t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 2 神经病理性疼痛大鼠模型的建立 通过宽松结扎大鼠坐骨神经制备CCI神经病理性疼痛模型。以Von Frey法测定机械刺激缩足反射阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT), 术后7 d MWT较基础痛阈下降40%以上者视为CCI模型成功, 可以进行后续实验。

MWT测定：手术前和手术后3、7、10和14 d分别测量机械痛阈值, 评价造模前后的机械性痛觉超敏情况。结果如图一所示, 手术前两组大鼠的MWT无统计学差异。CCI造模以后, 与正常组(Control)相比, 手术组(Model)大鼠的MWT在各个时间点均显著缩短(P< 0.01), 并在术后第7天数值达到平台期, 较基础痛阈下降约50 %(P<0.01, 见图1)。结果表明手术诱发了大鼠的机械性痛觉超敏, CCI模型成功。

图1 CCI手术对SD大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响(±s, n = 6)

2. 3 黄芩苷对正常大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响 正常SD大鼠18只, 分为溶媒组和黄芩苷组。黄芩苷组分为10 μg/只和20 μg/只两个不同剂量组, 每组6只。给药方式为椎管内给药, 给药体积为20 μl/只。溶媒组椎管内注射等体积的0.05%的 DMSO, 。测定给药前0 h和给药后1 h, 2 h, 4 h,8 h和24 h的MWT。

结果可见, 黄芩苷两个不同剂量对大鼠的MWT均无显著性影响(P>0.05, 见图2)。结果表明, 黄芩苷在10 μg/只的剂量下, 对基础机械学痛觉阈值没有影响。

图2 黄芩苷对正常大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响( ±s, n = 6)

2. 4 黄芩苷对CCI大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响 筛选CCI造模成功的大鼠, 于手术后第14天开始给药。分CCI模型组, 吗啡组和黄芩苷治疗组。黄芩苷组分为10 μg/只和20 μg/只两个不同剂量组, 给药方式为椎管内给药, 每组6只。测定给药前0 h和给药后1 h, 2 h, 4 h, 8 h和24 h的MWT。吗啡组椎管内注射一次盐酸吗啡, 剂量为10 μg/只, CCI模型组则注射相同体积生理盐水, 吗啡组和模型组行为学测定方法同黄芩苷治疗组。见图3。

结果可见, 与模型组比较, 黄芩苷两个不同剂量单次给药后均具有显著的镇痛作用, 且具有剂量相关性(P<0.05), 同时作用时间维持较长, 镇痛作用大于8 h。而吗啡给药2 h后,即没有显著镇痛作用。结果表明：黄芩苷可显著抑制CCI导致的大鼠机械性痛觉超敏, 且镇痛作用维持时间较长。

图3 黄芩苷对CCI神经病理性疼痛模型机械刺激缩足反射阈值的影响(±s, n = 6)

3 讨论

越来越多的研究表明: 胶质细胞的激活包括小胶质细胞的异常激活在神经病理性疼痛中发挥着重要作用［4］。神经损伤可以导致脊髓水平的小胶质细胞细胞异常激活。小胶质细胞激活后, 产生大量细胞因子、炎性介质和神经活性物质, 进而增强脊髓背角神经元的兴奋性, 如ROS、NO、PGs、EAAs、ATP、花生四烯酸、TNF、神经生长因子、白细胞介素等。过量的这些物质积聚在脊髓背角, 使病理性疼痛进一步发展和持续。通过抑制胶质细胞激活, 可阻断这一系列病程的发生与发展。

有研究显示, 黄芩提取物可通过抑制NO的生成以及抑制小胶质细胞的COX2的表达, 进而显著抑制LPS诱发的小胶质细胞活化, 并抑制前炎性细胞因IL-1β、IL-6和TNF-α的释放。而神经损伤后, 脊髓水平活化的小胶质细胞释放的IL-1β、IL-6、TNF-α对病理性疼痛的发生和持续起着重要作用, 利用针对它们的中和性抗体可以显著抑制CCI导致的机械学超敏［5,6］。同时有文献报道黄芩苷在体内的代谢物可通过血脑屏障进入中枢神经系统, 发挥神经保护效应［7］。

正是由于黄芩苷具有以上特点, 作者推测黄芩苷可能对神经损伤导致的小胶质细胞异常活化有抑制作用。利用小胶质细胞的抑制剂可以抑制神经损伤导致的机械性痛觉超敏,所以作者首先研究了黄芩苷对CCI导致的机械性痛觉超敏的影响。

本研究首次发现,黄芩苷可以显著抑制CCI导致的大鼠机械性痛觉超敏。作者推测其作用机制可能与抑制脊髓水平的小胶质细胞活化有关。同时作者的研究还发现, 两个不同剂量的黄芩苷均不影响正常大鼠的基础机械学痛阈, 说明黄芩苷对脊髓水平的正常伤害性感受信息调制没有显著影响。

吗啡类药物被广泛应用于治疗神经病理性疼痛。但是吗啡的镇痛作用持续时间较短, 为了有效控制疼痛, 需要持续大剂量给药。而这将会带来成瘾, 耐受和胃肠道反应等副作用, 极大地限制了吗啡的临床应用。作者的数据表明,黄芩苷虽然在相同剂量下的镇痛效率上不如吗啡, 但是其镇痛持续时间优于吗啡。20 μg黄芩苷的镇痛持续时间>8 h,是10 μg吗啡的2倍以上。这表明了以黄芩苷作为先导化合物研发新的治疗神经病理性疼痛的药物, 具有较大潜力。

综上所述, 本文首次证实了黄芩苷对神经病理性疼痛进程中机械性痛觉超敏的治疗作用, 并发现了其镇痛持续时间优于吗啡。但是黄芩苷通过何种分子机制发挥治疗神经病理性疼痛的作用, 仍需更深层次的研究和探讨。

［1］ 冯友根．邹晓华．国内黄芩苷药理作用研究与临床应用概述．中国医药情报, 2004, 10(2): 35-43．

［2］ Chen CJ, Raung SL, Liao SL, et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase expression by baicalein in endotoxin/cytokinestimulated microglia. Biochem Pharmacol.Biochem Pharmacol,2004, 67(5): 957-965.

［3］ Woo KJ, Lim JH, Suh SI, et al. Differential inhibitory effects of baicalein and baicalin on LPS-induced cyclooxygenase-2 expression through inhibition of C/EBPbeta DNA-binding activity.Immunobiology. Immunobiology, 2006, 211(5): 359-368.

［4］ Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy. Pain, 2013.

［5］ Gao YJ, Zhang L, Samad OA, et al. JNK-induced MCP-1 production in spinal cord astrocytes contributes to central sensitization and neuropathic pain. J Neurosci, 2009, 29(13): 4096-4108.

［6］ Kawasaki Y, Xu ZZ, Wang X, et al. Distinct roles of matrix metalloproteases in the early- and late-phase development of neuropathic pain. Nat Med, 2008, 14(3): 331-336.

［7］ Tarragó T, Kichik N, Claasen B, et al. Baicalin, a prodrug able to reach the CNS, is a prolyl oligopeptidase inhibitor. Bioorg Med Chem. Bioorg Med Chem, 2008, 16(15): 7516-7524.