1例羊毛状发家系脂肪酶H基因检测

马俊红，王昕，肖生祥

（1.清华大学第一附属医院，北京100016；2.西安交通大学第二附属医院，西安710004）

羊毛状发(woolly hair)于1919年由Gottiieb首先报道，是一种少见的先天性毛发异常性疾病。羊毛状发常在2岁前出现，表现为局部或弥漫性毛发松动生长缓慢，颜色灰白，毛发纤细脆弱易断裂。羊毛状发可以单独发病，也可以是某些遗传综合征如Naxos和Carvajal综合征的部分表现[1-2]。单纯羊毛状发可呈常染色体显性遗传（MIM 19400）或隐性（MIM 278150）两种遗传模式。最近报道一些常染色体隐性遗传羊毛发患者不仅表现羊毛发，还有不同程度的毛发稀疏/少毛[3]。近年的研究发现G蛋白偶联受体（purinergic receptor P2Y,G protein-coupled 5,P2RY5）和脂肪酶 H（lipase－H,LIPH）基因突变可引起常染色体隐性羊毛发/稀毛症[4-5]。最近我们确诊1例散发羊毛状发患者，进行了P2RY5和LIPH基因检测，并确定了一新突变，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料 先证者，女，21岁。自出生后头发即稀疏、卷曲、柔软，头发颜色灰白。患者自有记忆以来未曾剪发过，头发缓慢生长至10 cm左右便基本停止生长，平时头发易缠绕，不易梳通，轻拔毛发即脱落。患者无智力及骨骼发育异常。既往体健，足月顺产。平素月经规律。其父母非近亲结婚，家族成员中无类似疾病患者。体格检查：营养、智力、骨骼发育均正常，心、肺检查无异常。皮肤科检查：头发稀疏、柔软，触之有绵羊毛状感，毛发呈螺旋状卷曲蓬松。类似烫发，呈淡灰白色，表面无光泽，见图1b。头皮毛囊无角化、隆起，毛发远端未见分叉。眉毛稀疏，腋毛、阴毛、体毛缺如。双拇趾甲见横沟，甲松脆。未见掌跖角化过度。无全身出汗不良。光学显微镜下见发断面呈不规则形，毛发粗细及黑素均匀。毛干表面见多数不规则小突起，无结节、气泡。不呈管状。电镜下见毛干表面有纵沟，毛小皮结构呈波纹状排列，部分毛皮质游离缘外翘突起或呈锯齿状，见图 1c，d[6]。诊断：羊毛状发。

图1 羊毛状发患者家系和临床特征（a）家系图，（b）患者临床表现（c、d）毛发电镜图：不规则排列的毛小皮，锯齿状游离缘

1.2 基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）提取 经院伦理委员会同意，获得患者知情同意后采集患者及其他3例家属的静脉血液5 mL，置2%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝管中，使用全基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA（试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供），同时抽取100例无关正常人外周静脉血作为对照。

1.3 PCR扩增及测序 参考文献[5-6]设计引物，设计针对P2RY5和LIPH基因的所有编码区和外显子侧翼区50～200 bp引物。其中LIPH基因3号外显子引物：LIPH-4F 5′-GCCTCAGTTTCCTCATCTGC-3′，LIPH-4R 5′-CAATGACCCACACTCAGAG-3′。扩增片段大小为433 bp，PCR反应体系：dNTP Mixture（10mmol/L）25μL，上下游引物各（25μmol/L）1.5μL，模板 DNA 10 μL，加水至 50 μL。扩增条件：94℃预变性10 min，然后94℃ 30 s，60℃ 60 s，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳证实为所需产物，所有PCR产物纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果与人类基因组LIPH基因序列比较。

2 结果

2.1P2RY5 首先对P2RY5基因所有外显子检测，没有发现任何碱基改变。

2.2LIPH基因检测结果 在LIPH基因第3号外显子发现一个碱基改变，c.454G>A，该突变位于cDNA的第454位，此碱基变化将使得LIPH蛋白第152位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸（p.G152R），见图2a。而其父母和妹妹均无此碱基改变，见图2b，100例无关人群基因组检测未发现相同碱基改变,表明此碱基改变不是一个单核苷酸多态性（SNP）。

图2 LIPH基因3号外显子测序图（a）先证者杂合性突变c.454G>A；（b）先证者的父母亲和妹妹；（c）正常人群未检测到该突变

3 讨论

羊毛状发是一种临床少见的遗传性毛发疾病，近10年来研究者们陆续发现P2RY5基因为其致病基因，并发现许多碱基突变。但由于羊毛状发表现不仅仅出现在羊毛状发患者，一些其他毛发疾病或综合征也可出现羊毛状发表现。最近在一些具有羊毛状/稀毛症患者基因组中检测到LIPH基因碱基突变。笔者对一个羊毛状发家系进行基因检测，并在LIPH基因中检测到一个新发突变。此突变为一杂合性错义突变。目前已在不同地区和种族检测到20多种突变，这些突变包括移码突变和错义突变和剪接突变。大多数突变是纯合性突变，其次是复合杂合性突变形式。本例患者来自一个非血缘关系家庭，临床表现及毛发电镜均证实为羊毛状发。最初我们认为患者为常染色体隐性遗传模式，但是P2RY5基因序列分析未发现任何碱基改变。随后对LIPH基因检测发现3号外显子第454位一个碱基G到A改变，即c.454G>A（p.G152R），此碱基改变为一杂合性改变，而在其父母亲和100例无关人群中未发现此碱基改变，亦未发现其他形式的缺失突变类型，因此认为c.454G>A（p.G152R）为一新生突变，该患者可能为常染色体显性遗传模式。

LIPH基因编码一种451个氨基酸的蛋白质LIPH，分子质量55 ku，是哺乳动物三酰甘油脂肪酶家族的膜结合成分，主要功能是催化产生2-酰基溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）。LIPH蛋白和其他脂肪酶成员一样，在氨基末端催化区的154，178，248位置有3个具有催化作用的残基，其具有一个β9回路（β9 loop）和一个类似盖子的区域（lid domain），这两个被认为是识别底物的关键结构[7]。LPA是具有多种生物活性的磷脂介质，活体内试验显示其有促进毛发生长作用。LPA主要通过细胞表面特异的受体蛋白发挥作用，称G蛋白偶联受体。P2Y5为LPA一种受体。P2Y5是由P2RY5基因编码的G蛋白偶联型受体[8]。研究显示P2Y5蛋白在内毛根鞘的亨利层和赫胥黎层与基底膜层有表达[9]。最近研究发现人类LIPH基因在毛轴内膜根鞘的赫胥黎层，外毛根鞘也有大量的表达。由此可见LIPH基因和P2RY5基因在毛囊内毛根鞘的赫胥黎层和基底膜层有显著的重叠。这些研究都提示LIPH/LPA/P2RY5途径在毛囊发育和毛发生长中的重要作用[10]。本研究中发现的p.G152R突变发生在LIPH蛋白N-末端的氨基酸催化残基154位附近，精氨酸（Arginine,R）是高度碱性氨基酸，甘氨酸（Glycine,G）是非极性的。因此，突变p.G152R很可能严重影响LIPH蛋白的构象，以及可能会影响LIPH蛋白二级结构或蛋白质折叠，进一步导致蛋白质降解。另外LIPH蛋白的152位氨基酸残基在不同物种间是高度保守的见图3，表明此蛋白在生物进化中具有重要功能活性，此位点碱基改变将严重影响LIPH蛋白的生物功能。综上所述，笔者认为p.G152R突变引起了患者毛发生长和结构发生改变，从而导致患者临床表型。

综上，本研究报道一个LIPH基因杂合性错义突变，此突变增加了羊毛状发患者突变基因库，也间接证实了LIPH/LPA/P2Y5轴在人类的头发生长发育中的关键作用。

图3 (a)LIPH蛋白氨基酸结构。*表示Ser154（第3外显子），Asp178（第4外显子），His248（外显子6）3个催化残基。红色显示本研究突变p.G152R，位于Ser154催化残基附近。β：β9回路;LD：盖域。（b）不同物种间LIPH氨基酸序列比较：显示152位氨基酸高度保守。

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