七白膏对中波紫外线诱导豚鼠色素沉着模型的影响研究

任金平 ，王平 ，王媚 ，倪亚杰

（1.浙江中医药大学，杭州310053；2.浙江省杭州市第三人民医院，杭州310009）

皮肤色素沉着临床十分普遍，严重者损容，给患者带来很大的心理负担，影响患者生活质量。日光中的中波紫外线被认为是引起皮肤色素沉着的主要原因。由于色素沉着的发病机制至今仍未完全阐明，尽管临床上治疗方法层出不群，但一直缺乏起效较快、有效率高、不良反应小、复发率低的治疗方法。近年来中药对皮肤色素沉着的改善作用引起广泛关注，临床上外用中药美白制剂治疗黄褐斑等皮肤色素沉着有效，七白膏就是其中具有代表性的的一个。本研究选择七白膏，应用于中波紫外线诱导的皮肤色素沉着动物模型，通过观察黑色素指数、黑素细胞及黑素颗粒变化，来客观评价药物的治疗作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 采用普通级健康雄性棕黄色豚鼠10只，10周龄，体质量240～260 g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，委托该中心饲养。每只实验豚鼠背部取4块相离的区域，紫外线光疗仪建模后分别外涂药物。

1.1.2 药物 中药七白膏由白术、白芷、白芨、白蔹、白附子、白茯苓、细辛外加鸡子白组成[1]，各味中药均购自江苏江阴天江药业有限公司，委托专业药师进行质量鉴定，经杭州市第三人民医院制剂室制成乳膏制剂；2%氢醌乳膏购自广东人人康药业有限公司生产，国药准字H20040088，生产批号20110503；白术单体乳膏和单基质乳膏由杭州市第三人民医院制剂室制作。

1.1.3 仪器 SS-04B型紫外线光疗仪（上海希格玛高技术有限公司）；MPA9型皮肤多功能生理测试仪（德国CK公司）；皮肤共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)，美国微维VIVASCOPE 1500型，波长830 nm，最大输出16.0 mW；黑素染色试剂盒（产品编号MST-8015）购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色素沉着模型制作 使用SS-04B型紫外线光疗仪。照光前电动剃毛刀将豚鼠背部棕黄色长毛剃除，再以女用脱毛膏脱去短毛以充分裸露背部皮肤。紫外线光疗仪正对豚鼠皮肤距皮肤15 cm左右，根据文献[2]每次照射能量为500 mJ/cm2，隔日1次，共3次。每次照射后豚鼠皮肤可出现轻度发红，但无肿胀，无水疱、血疱。

1.2.2 动物分组和给药 每只实验豚鼠背部取4块相离区域，于建模成功后分别给予七白膏药膏、2%氢醌乳膏、白术单体和单基质乳膏外涂，2次/d，持续4周，用药过程中每隔3天脱毛1次。

1.2.3 黑色素指数测定 应用MPA9型皮肤多功能生理测试仪，于建模前后和用药4周后分别测定豚鼠背部各区域皮肤黑色素指数变化。

1.2.4 活体下黑色素及黑素细胞观察 应用CLSM，实时动态观察建模前后和用药4周后豚鼠背部各区皮肤黑色素和黑素细胞的变化情况。

1.2.5 组织病理观察 豚鼠皮肤常规石蜡切片，FeSO4染色，光镜下观察黑色素含量的变化。每张切片随机取5个高倍镜视野运用病理图像分析仪对黑素颗粒进行计数统计，取平均值。

1.3 统计学方法 数据用均数±标准差（）表示，各组间采用t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义，使用SPSS17.0统计软件作数据统计分析。

2 结果

2.1 皮肤颜色变化 SS-04B型紫外线光疗仪照射（总能量1500 mJ/cm2）豚鼠背部皮肤。照射结束后1 d皮肤出现轻微红斑，3 d后出现脱屑，5～7 d后出现色素沉着，照射结束1周后色素沉着达顶峰且稳定，然后开始外用药物。七白膏实验组用药过程中未见明显红斑、脱屑等不良刺激，用药4周后色素沉着显著减退；2%氢醌组，用药4～6 d皮肤出现发红、脱屑，4周后色素沉着明显减退；白术单体组用药过程中未见发红、脱屑，用药4周后色素减退不明显；单基质组4周后未见明显色素减退。

2.2 黑色素指数比较

2.2.1 照光前和3次照光结束后1周黑色素指数比较 紫外灯照射后皮肤黑色素指数较照射前显著升高（P<0.01），见表1。

表1 照光前后豚鼠皮肤黑色素指数比较 （±s）

表1 照光前后豚鼠皮肤黑色素指数比较 （±s）

注：与照光前比较，*P<0.01。

组别 n 黑色素指数照光前 40 170.00±60.36照光后 40 352.50±91.35*

2.2.2 用药前后各组黑色素指数比较 单基质乳膏外用4周后，黑色素指数较用药前无明显变化（P>0.05）；白术单体外用4周后，黑色素指数较用药前变化不明显（P>0.05）；2%氢醌乳膏连用4周后，黑色素指数较用药前显著下降（P<0.01），七白膏组连用4周后，黑色素指数较用药前显著下降（P<0.01）。白术单体组与单基质乳膏组相比黑色素指数差异无统计学意义（P>0.05）；2%氢醌组与单基质乳膏组相比黑色素指数明显下降（P<0.01），较白术单体组明显下降（P<0.01）；七白膏组与单基质乳膏组相比黑色素指数显著下降（P<0.01），与白术单体组相比明显下降（P<0.01）但与2%氢醌组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 药物干预前后各组皮肤黑色素指数比较 （±s）

表2 药物干预前后各组皮肤黑色素指数比较 （±s）

注：*P<0.01；△P>0.05。

组别n 药物干预前 药物干预后单基质乳膏组 10白术单体乳膏组 10 353.30±101.62 322.60±85.63△344.00± 86.97 323.20±85.06△2%氢醌乳膏组七白膏组1010354.70± 87.41 208.90±66.54*358.00±101.34 203.20±63.43*

2.3 CLSM观察造模前后及药物干预前后各组黑素细胞及黑素颗粒的变化 紫外线光疗仪照射后，CLSM下豚鼠表皮基底层可见大量树枝状黑素细胞及色素颗粒，黑素细胞功能活跃；与治疗前相比，单基质乳膏组和白术单体组外用4周后，黑素细胞和色素颗粒未见明显变化，而2%氢醌组与七白膏组树枝状黑素细胞数量及色素颗粒明显减少。见图1。

图1 CLSM下黑素细胞和色素颗粒改变

2.4 组织病理学观察 紫外线光疗仪照射后各区域皮肤黑素颗粒显著增多；单基质乳膏组使用4周后未见明显黑素颗粒减少迹象；白术单体组连续用药4周后黑素颗粒减少不明显；2%氢醌组连续应用4周，黑素颗粒较外用单基质乳膏组明显减少；七白膏组外用4周后黑素颗粒较单基质乳膏组明显减少。见图2。组织切片中黑素颗粒计数结果见表4。

图2 照光后及用药4周后各组皮损组织病理像（F e S O4染色 ×100）

表4 组织切片中黑素颗粒计数分析

3 讨论

皮肤色素沉着是皮肤科常见的一类疾病，易诊难治，严重影响患者生活质量和心理健康。日光中的中波紫外线辐射越来越受到关注。近年来UVB照射豚鼠构建色素沉着实验动物模型已被成功应用[3]。根据文献资料[2]，豚鼠UVB的最小红斑量为200～300 mJ/cm2，采用局部双倍最小红斑量的紫外线剂量（500 mJ/cm2）分次间歇照射棕黄色豚鼠的方法,既减少红斑水疱的发生,又可形成稳定均匀的色素沉着,便于实验中观察和数据记录。本研究选择单次500 mJ/cm2，总剂量1500 mJ/cm2的方法所形成的色素沉着均匀、稳定。

皮肤色素沉着的治疗一直是困扰医生和患者的一个难题，尽管治疗方法很多，但缺乏一种疗效确切、不良反应小、不易复发的治疗方法。氢醌是较经典的皮肤脱色剂，外用可引起局部皮肤红斑、脱屑瘙痒和刺痛等不良刺激，刺激性与浓度及接触时间有关[4]。研究表明黑素细胞过度增殖和黑素合成进行性增多是导致色素沉着发生或加重的重要因素[5]，抑制黑素细胞增殖和黑素合成可减少皮肤色素沉着的发生和发展。理想的皮肤脱色剂是能直接或间接抑制黑素细胞增殖和黑素合成，脱色迅速且无明显不良刺激、不易复发的制剂。近年来随着祖国医药的现代化开发应用，一大批经方显现出其独特的优势，七白膏就是其中具有代表性的一个方剂，中药七白膏源自宋代太平圣惠方[1]，主要由白术、白芷、白芨、白蔹、白附子、白茯苓、细辛外加鸡子白组成，张建华等[6]对不同文献的“七白膏”中涉及的10味中药分别进行萃取，体外观察各提取物对黑素细胞增殖及黑素合成的影响，发现10味中药提取物对黑素细胞增殖和黑素合成均有抑制作用。本研究发现七白膏能有效抑制黑素细胞增殖和黑素合成，从而减轻皮肤色素沉着，且在用药过程中不会出现类似氢醌的红斑、脱屑等不良刺激。

综上所述，外用经方七白膏治疗皮肤色素沉着的疗效与氢醌相当，能显著抑制黑素细胞活性和减少黑素颗粒的产生，但对皮肤的刺激性很小或几乎无刺激，尤其适合于黄褐斑、炎症后色素沉着等色素增加性皮肤病的防治，是比较理想的脱色剂，值得深入研究并推广应用于临床。

［1］王怀隐.太平圣惠方[M].北京：人民卫生出版社,1982:1200-1235.

［2］ Tobiishi M,Haratake A,Kaminaga H,et al.Pigmentation in intrinsically aged skin of A1 guinea pigs[J].Pigment Cell Res,2004,17:651-658.

［3］ Maeda K,Naganuma M.Topical trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid prevent ultraviolet radiation-induced pigmentation[J].J Photochem Photobiol B,1998,47:136-141.

［4］Mauricio T,Karmon Y,Khaiat A.A randomized and placebocontrolled study to compare the skin-lightening efficacy and safety of lignin peroxidase cream vs.2%hydroquinone cream[J].J Cosmet Dermatol,2011,10:253-259.

［5］ Jeon S,Kim NH,Koo BS,et al.Bee venom stimulates human melanocyte proliferation,melanogenesis,dendricity and migration[J].Exp Mol Med,2007,39:603-613.

［6］张建华，王婷，李华，等.七白膏各中药萃取物对黑素细胞增殖及黑素合成的影响[J].上海中医药杂志，2009，43（1）：84－86.