血清蛋白质指纹图谱对晚期结直肠癌一线化疗效果的预测作用

沈虹 袁瑛 李晶晶 房雪峰 谭纯文 余捷凯 郑树

·论著·

血清蛋白质指纹图谱对晚期结直肠癌一线化疗效果的预测作用

沈虹 袁瑛 李晶晶 房雪峰 谭纯文 余捷凯 郑树

目的寻找能预测晚期结直肠癌一线化疗疗效的血清蛋白标记物。方法选择2008年8月至2010年7月在浙江大学医学院附属第二医院的70例从未接受过治疗的晚期结直肠癌患者，其中44例患者接受FOLFOX方案化疗，26例患者接受FOLFIRI方案化疗，进行4个疗程治疗后使用RECIST评价标准区分化疗受益者(R)和化疗无效者(NR)。留取化疗前患者血清标本，采用SELDI-TOF-MS和人工神经网络对一线化疗的疗效进行预测分析。结果根据RECIST标准，42例患者为化疗受益者，28例患者为化疗无效者，分析两组患者血清蛋白质指纹图谱的差异，筛选出10个蛋白质峰在化疗受益组的表达明显高于化疗无效组；并由这10个峰构建出结直肠癌一线化疗疗效的预测模型。经交叉验证，该模型的总准确率为90.0%(63/70)。结论蛋白质指纹图谱模型是预测晚期结直肠癌患者一线化疗方案治疗效果的有效方法之一。

生物学标记； 结直肠肿瘤； 蛋白质阵列分析

全身化疗是治疗晚期结直肠癌患者最主要的手段。5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸钙联合奥沙利铂(FOLFOX)或伊立替康(FOLFIRI)治疗方案是两个标准的一线化疗方案，其有效率均约为40%，因此仍有一些患者要面对化疗失败、疾病进展的可能。对于这两个一线方案的选择，目前临床上未有明确的标记物可用来预测疗效并选择出各自适合的患者。因此，如能找到合适的预测手段，在化疗前就能将对某一种化疗方案的受益人群筛选出来，进行个体化的治疗，这将有益于患者的治疗及预后。

SELDI-TOF-MS作为近年来发展起来的蛋白质组学研究手段，能够直接对临床样本进行检测，结合生物信息学分析将有可能从患者血清样本的大量蛋白质和多肽信息中筛选出具有不同意义的潜在标志物，并建立起具有较高诊断效力的蛋白质指纹图谱检测模型。本研究应用SELDI蛋白质芯片对晚期结直肠癌患者中经一线化疗方案治疗的受益者和无效者的血清蛋白质指纹图谱进行检测，结合人工神经网络模型(artificial neural network，ANN)和支持向量机等生物信息学方法，初步建立了蛋白质指纹图谱晚期结直肠癌化疗敏感性的预测模型，并探讨了该模型在晚期结直肠癌患者经一线化疗方案治疗的疗效预测方面的应用价值。

资料与方法

一、资料

收集2008年8月至2010年7月在浙江大学附属第二医院接受治疗的70例经病理确诊为转移性结直肠癌患者，每例患者均可进行确切的疗效评估。所有患者均为初治或近6个月内未行化疗及其他抗肿瘤药物治疗者。其中男性37例，女性33例；年龄42～74岁，中位年龄60岁；结肠癌44例，直肠癌26例；高、中、低(包括黏液腺癌及印戒细胞癌)分化腺癌分别为16例、30例、24例；转移器官为2处的9例,3处以上9例，其余为单器官转移；肝转移41例,肺转移26例,腹膜转移9例，腹膜后转移2例，骨转移3例。

化疗期间不采用其他抗肿瘤治疗方式，包括放疗、手术、免疫治疗等。经本院伦理委员会同意，所有患者均签署知情同意书。收集所有患者首次化疗前的血清，所有血样均于清晨空腹采集，在无抗凝剂的5 ml普通采血试管中室温静置1～2 h，使血液凝固析出血清，2 000 r/min离心5～10 min，冰浴上分装血清于0.5 ml的Eppendorf管中，每管20～50 μl，-80 ℃低温冰箱保存备用。

二、化疗方案

FOLFOX或FOLFIRI方案化疗4个疗程。(1)FOLFOX方案：第1天静脉滴注奥沙伯铂85 mg/m2(体表面积)共2 h，亚叶酸钙400 mg/m2(体表面积)共2 h；第1天静永滴注5-FU 400 mg/m2(体表面积)共46～48 h，连续滴注2 d。(2)FOLFIRI方案：第1天静脉滴注伊立替康180 mg/m2(体表面积)共30～90 min，亚叶酸钙400 mg/m2(体表面积)与伊立替康180 mg/m2(体表面积)同时滴注共30～90 min;第1天静脉滴注5-FU 400 mg/m2(体表面积)共46～48 h，连续滴注2 d。

疗效评价：参照实体瘤的疗效评价RECIST(response evaluation criteria in solid tumors)1.0标准分为：进展(progressive disease,PD)、稳定(stable disease,SD)、部分缓解(partial response,PR)和完全缓解(complete response,CR)。分别于4次化疗后评价疗效。临床受益者为CR、PR或SD的患者；临床无效者为PD的患者。

三、SELDI-TOF-MS

(一)实验操作

血清标本冰浴中解冻，10 000 r/min离心5 min(4 ℃)，10 μl U9血清处理液中加入血清5 μl，摇床上振荡使充分混合(4 ℃,600 r/min，30 min)。用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200 μl用于上样，摇床上振荡使充分混合(4 ℃,600 r/min，2 min)。取上述经U9处理并稀释过的血清100 μl加到芯片上，芯片与血清充分反应1 h(4 ℃,600 r/min摇床上振荡)后去除样品。反应结束甩干芯片表面液体,依次以50 mmol/L乙酸钠溶液(pH=4.10)清洗芯片3次,每次5 min;去离子水快速清洗2次。芯片自然干燥后点加100 μl SPA 2次,待干燥后行质谱仪检测。

(二)数据处理与生物信息学分析

质谱仪参数设定为激光强度165，检测灵敏度7，检测上限60 000 m/z，优化收集数据范围2 000 ～30 000 m/z(蛋白质质量和电荷比值,以下简称质荷比)，信号收集位置20～80，每个样本取120个点收集信号的平均值。原始数据先以Proteinchip Software 3.2软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，设置初始噪音过滤值5(信号与噪音比值，signal/noise，S/N)，设二次噪音过滤值为2，以10%为最小阈值进行聚类。然后用t检验或Mann-Whitney秩和检验(后者用于处理偏态分布数据)比较各组血清蛋白质指纹图谱数据(由Proteinchip Software 3.2自带的Biomarker Wizard 3.1软件完成)，寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。将结直肠癌患者化疗前血清蛋白质质谱数据导入ZJUCIPDAS网络服务软件。选择受益组和无效组间差别最显著的10个蛋白质峰或所有P值小于0.05的蛋白质峰数据进行分析，筛选出Youden指数最高的质荷比峰值组合，用SVM留一法和判别分析留一法建立模型。每组分析样本为n个，在所有样本中随机抽取n-1个样本设为训练集用于建立模型，剩下的1个样本作为测试集进行交叉验证。如此抽样、训练及验证过程重复n次，以期得到最为接近真实值的结果。最后同时输出SVM、原始判别以及两者交叉验证的结果，并用时间序列分析的方法用二维散点图的形式表示。

结 果

一、化疗疗效

70例行FOLFOX或FOLFIRI方案化疗的结直肠癌患者，在4次化疗后经RECIST标准判断疗效，42例被判断为临床受益者，28例为临床无效者。临床受益者：CR 0例，PR 22例，SD 20例

二、SELDI-TOF-MS结果

1.建立晚期结直肠癌化疗疗效预测模型:通过对晚期结直肠癌患者中42例化疗受益者与28例无效者血清蛋白质质谱数据的比较，共检测到蛋白质峰100个(信号与噪声比值，S/N=5时)，其中表达差异有统计学意义(Plt;0.05)的蛋白质峰14个。通过交叉验证，判别分析软件筛选出10个蛋白质峰(质荷比为9286 m/z、9431 m/z、9375 m/z、9298 m/z、4304 m/z，9352 m/z，9404 m/z，4606 m/z，9198 m/z，3963 m/z)组合构建成的结直肠癌化疗疗效预测模型具有最高的总准确率(表1)。

2.模型训练及交叉验证：将这70份样本随机分成训练组和测试组，进行交叉验证，通过这10个蛋白峰的鉴别，42例化疗受益的样本中有39例被准确预测，28化疗无效的样本中有24例被准确预测。结果表明，该预测模型的灵敏度为90.7%(39/43)，特异度为88.9%(24/27)，总准确率为90.0%(63/70)(表2)。

讨 论

结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一。全身化疗是晚期结直肠癌患者最主要的治疗手段。氟尿嘧啶联合亚叶酸钙(5-FU+LV)方案是最经典的选择。随着奥沙利铂和伊立替康分别在1996年和2002年在美国上市，大量的随机临床试验均报道奥沙利铂联合5-FU、LV方案与伊立替康联合5-FU、LV方案在晚期结直肠癌患者的治疗中有较好的效果[1-5]。美国国家综合癌症网(NCCN)临床指南指出FOLFOX(5-FU+LV+奥沙利铂)和FOLFIRI(5-FU+LV+伊立替康)均可作为晚期结直肠癌患者的一线化疗方案。这两个方案的临床有效率相当，均约为40%(CR+PR)。因此，仍有多数患者要面对化疗失败、疾病进展的可能。而临床上至今并未有明确的标记物可用来预测化疗疗效和选择适合的患者。因此，如能借助一些生物标记物在最初的治疗中选择合适的化疗方案，将会极大减少治疗的盲目性，减少病人痛苦，提高治疗的有效率，继而获得生存率的提高。

目前在临床上常用的结直肠癌肿瘤标记物有糖类抗原199、癌胚抗原等，其对肿瘤诊断及随访监测具有较高的价值，但这些肿瘤标记物的敏感性和特异性并不高，存在相当比例的“假阳性”和“假阴性”，且不能用于疗效预测。PET-CT检查等影像学手段常用来评价肿瘤治疗的效果，由于灵敏度低限制了其应用于肿瘤疗效的早期监测。因此，寻找有效的无创检测手段、获得相应的肿瘤标记物用于指导临床治疗是目前关键所在。

SELDI-TOF-MS蛋白质芯片系统已广泛应用于多种恶性肿瘤的诊断，包括乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、消化系统恶性肿瘤[8]以及卵巢癌[9]等。相关研究报道中，已将SELDI-TOF-MS蛋白质芯片系统用于结直肠癌的鉴别诊断、术前病理分期、预后评估及术后复发转移评估等方面[10-14]。Smith等[15]使用该系统对结直肠癌患者进行的研究中，发现直肠癌患者经新辅助治疗1～2 d后血清蛋白质谱将发生改变，可判定治疗效果，敏感率为87.5%，特异性为80%。Zheng等[12]研究发现结直肠癌患者在术后两周，其血清蛋白质谱发生微小的变化，但这种变化与疾病状态的具体关系仍旧不明。Christopher等[16]对结直肠癌手术患者术前血液进行检测，发现病期较晚的患者术前确诊为癌的可能性更高。因此认为血清蛋白图谱能判断预后，帮助制定辅助治疗方案。但这些研究仍倾向于疗效的监测和预后评估，并没有直接对某化疗药物疗效进行预测评估。

表1 晚期结直肠癌患者化疗受益者(42例)与无效者(28例)蛋白质峰的比较

续上

蛋白质峰(m/z)4304935294044606919839631584．676±827．35343．3679±360．18388．40±465．05333．09±603．851602．84±2232．48702．11±441．07947．1406±506．90174．2481±244．07213．93±378．27175．56±389．99710．29±1786．30500．28±305．920．0007070．0007070．0008060．0012340．0026730．044639

表2 结直肠癌患者化疗疗效与预测模型的交叉验证结果

本研究通过对经过一线化疗方案治疗的晚期结直肠癌患者中受益者与无效者血清蛋白质质谱数据的比较，筛选出10个蛋白质峰，组合构成结直肠癌化疗疗效预测模型，其总准确率为90.0%(63/70)，灵敏度为90.7%(39/43)。这些蛋白质峰在受益者血清中的表达均高于无效者。表明SELDI-TOF-MS与生物信息学分析相结合的方法，对化疗疗效的预测的准确率、灵敏度、特异度都较高。

综上所述，运用SELDI-TOF-MS系统结合生物信息学方法，可以筛选出能预测接受化疗的结直肠癌患者疗效相关的标志蛋白，建立高灵敏度和特异度的预测模型。因此，该预测模型的建立，为结直肠癌患者进行更好地个体化治疗提供了新的方法。但由于本研究样本量较小，其结果对于临床的应用价值还有待于通过扩大样本量及随访观察来进一步的验证。

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Researchonthebiomarkersforthepredictionofefficacyinfirst-linechemotherapyofmetastaticcolorectalcancerusingSELDI-TOF-MS

SHENHong＊，YUANYing，LIJing-jing，FANGXue-feng，TANChun-wen，YUJie-kai，ZHENGShu.＊DepartmentofMedicaloncology,The2ndAffiliatedHospital,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China

Correspondingauthor：YUANYing，Email：yuanying1999@zju.edu.cn

ObjectiveTo identify serum protein patterns which could predict the efficacy of first-line chemotherapy of metastatic colorectal cancer(CRC).MethodsSerum from 70 patients diagnosed as metastatic colorectal cancer before first-line chemotherapy were collected and analyzed for protein patterns using ANN analysis of SELDI-TOF-MS.Among the 70 cases,44 patients

FOLFOX regimen,while the other 26 patients received FOLFIRI regimen.After four cycles of the treatment,RECIST criteria were used to define the responders(R)and non-responders(NR).ResultsWith the method of SELDI-TOF-MS，10 protein peaks were identified to be significantly high expressed in 42 responders than in those 28 non-responders.A prediction model was constructed by the combination of these 10 peaks,which could achieve an accuracy of 90.0%(63/70)for the chemotherapy efficiency of CRC patients.ConclusionsThe prediction model combined of 10 protein peaks could be helpful for prediction of the first-line chemotherapy efficiency of metastatic CRC patients.

Biological markers； Colorectal neoplasms; Protein array analysis

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2013.02.05

310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院肿瘤内科(沈虹、袁瑛、李晶晶、房雪峰、谭纯文) ；浙江大学肿瘤研究所 恶性肿瘤预警与干预教育部实验室(余捷凯、郑树)

袁瑛，Email：yuanying1999@zju.edu.cn

2012-09-26)

(本文编辑：马天翼)