浅析微生物计数方法的回收率

柴海毅

（上海诺狄生物科技有限公司，上海 201612）

微生物的限度检验，定量微生物检验方法，待检的微生物在固体表面上生长，繁殖形成肉眼可见的菌落后，才能够得到定量的数值。这也就是在目前各个国家的药典和官方的指导原则中，微生物的限度检测的两种经典的检验方法：平皿法（Plate-Count Methods）和薄膜过滤法（Membrane Filtration）。凡是涉及微生物方法验证的各种验证试验，都是以恢复试验为基础的，微生物方法验证的实质就是评价和考察微生物恢复试验的可信度。恢复试验就是确认某一检验方法，它可以使加入其中的各种微生物都能够恢复生长。恢复生长是否被接受则是由恢复试验中各种测试菌的回收率来判定的。

微生物方法验证中回收率官方规定，中国药典2010年版 107页 附录Ⅺ J 微生物限度检查法中规定微生物计数方法验证中回收率的测试方法是加入50～100 CFU试验菌，回收率应不低于70%[1]。美国药典USP34-61中是这样规定微生物方法验证中回收率的：For solid media, growth obtained must not differ by a factor greater than 2 from the calculated value for a standardized inoculum[2]。

对于固体培养基，获得的生长结果不得超过由标准接种而来的计算值的两倍范围。

可见，中国药典对于回收率规定，不但规定了试验菌悬液的浓度，而且设定了一个极为严格的合格限度是不低于70%。微生物测试方法有别于化学检验的一个重要区别是，对照溶液（菌悬液）不是固定不变的，而是一直在动态变化的。原因就在于验证测试的微生物是一个有生命活动的个体，微生物时刻都处于自己的生长状态中，每种微生物又都有着各自的生长曲线，微生物计数的数值实际上是测试菌悬液的微生物生长曲线中处于各阶段即延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期微生物生长的平均值。美国药典对微生物方法验证判定标准的回收率并没有规定一个具体的数值，而是依据标准样品测试的计数值，为回收率设置了一个基于标准样品上下一定范围的回收率合格区间。测试样品中微生物数量是否正确？验证回收率是否可以被接受？回收率的判定是随着标准对照样品中微生物的数量不同而变化的。也就是说每一次测试样品计数的微生物数量与标准对照样品计数的微生物数量的比值决定了这次回收率的合格的上下限，并没有设定一个单一的，固定不变的合格线。这样一个动态的回收率判定的规定，更加符合微生物的生长特性，在实际的检测和验证活动中更有实际意义。

那么，怎么来理解美国药典中关于回收率的2倍范围呢？

如果：

测试组计数 ≤ 2 × 对照组计数

如果对照组计数值是80CFU，那么测试组计数只要小于160CFU即认为是可以接受的；这实际规定了测试组的上限。

如果：

综上：

如果对照组计数值是80CFU，那么测试组计数只要大于40CFU即认为是可以接受的；这实际规定了测试组的下限。

上例中，假设对照组计数值是80CFU，那么这次测试计数回收率的合格区间就是40～160CFU，换言之，测试组的计数如果在40～160CFU之间，验证测试结果是可以被接受的。

从上面简单的数学公式推导，我们不难看出，美国药典回收率的合格区间就是对照菌落数的上下两倍，即50%～200%之间都是符合要求的。

目前，国内制药企业在微生物方法验证中存在的最大困惑有二：一是验证试验前测试菌悬液和标准菌悬液的浓度很难把握，不容易制成单位浓度为50～100CFU的验证菌悬液；二是回收率70%的标准难以达标。归结原因，就在于中国药典为回收率设置了两个必须同时达到的指标：50～100CFU菌悬液下，回收率要大于或等于70%。

假如参照美国药典的回收率标准，实施微生物方法验证的操作难度将大为改观。

中国药典也在与时俱进，相信不远的将来，中国药典收载回收率的判定标准也会更加如实反映微生物的生长特性，接近或达到国际通用的微生物回收率标准。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版二部[S].北京：中国医药科技出版社，2010:附录:XIJ:109.

[2] USP34版2010 <61>. MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS MICROBIAL EUMERATION TESTS.