重组大肠杆菌产腈水解酶的培养条件优化*

金利群，吴丛伟，柳志强，郑裕国，沈寅初

(浙江工业大学生物工程研究所，浙江 杭州，310014)

腈水解酶(Nitrilase，EC 3.5.5.1)是一种重要的腈转化酶，能一步催化腈化合物合成相应的羧酸，因其反应条件温和，污染少，且产物易于处理，被广泛应用于精细化学品和原料药的生产［1－3］。蛋氨酸又名甲硫氨酸，是必需氨基酸中唯一含硫的氨基酸，可被广泛应用于医药、食品、化妆品和饲料等领域，尤其以饲料添加剂的用量最大［4］。蛋氨酸作为饲料中必不可少的一种添加剂，在短期内可以迅速提高瘦肉量缩短培养周期，使其节省40%左右的饲料;在化妆品领域，蛋氨酸用于体内甲基的转移，可以有效延缓衰老。随着全球人口的不断增长和生活水平的提高，蛋氨酸的需求一直处于快速增长的态势［5］。目前世界上主要的蛋氨酸生产公司多采用浓H2SO4且在高温和高压下水解2-氨基-4-甲硫基丁腈最终获得蛋氨酸，反应条件剧烈、对设备腐蚀性大，同时产生大量的副产物、环境污染严重。

近年来，蛋氨酸的腈酶催化生产吸引了世界主要蛋氨酸生产公司的关注，相继开发腈转化酶催化工艺。如曹达公司和罗纳-普朗克公司先后研究了腈水解酶催化制备蛋氨酸及其衍生物的工艺，但其腈水解酶活力低，仅为100 U/gDCW，蛋氨酸产量不高，难以实现大规模生产［6－8］。本课题组在腈转化酶生物催化领域已作了多年的研究和探索，通过基因工程方法构建了重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT，能有效的催化水解2-氨基-4-甲硫基丁腈合成蛋氨酸(图1)，但该重组菌培养过程菌体量较低，影响催化剂的有效制备。对于以生产外源蛋白为目的的重组菌发酵，希望在发酵过程中获得尽可能多的目的蛋白，实现重组菌的高密度培养。分批补料培养是实现重组大肠杆菌高密度高表达培养的最常用和最有效的方法［9］。选择合适的补料培养基和流加策略，可创造出既适合菌体生长又适合酶表达的培养环境条件，常常成为实现高密度培养和高表达的关键因素［10－12］。

图1 腈水解酶制备蛋氨酸工艺Fig.1 Synthesis of methionine by nitrilase

为此，本论文在前期培养基优化的基础上，对重组菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT 在5 L 发酵罐上的补料分批培养工艺进行了研究，使该菌在保持酶活的同时能够大量且快速生长，为蛋氨酸的生物催化法工业化生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验菌种

重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT，目的基因源于 Acidovorax facilis (GenBank:444267)，由本实验室构建。

1.2 实验装置

采用RALF plus 5 L 发酵罐，瑞士Bioengineering公司。

1.3 培养基

1.3.1 种子培养基( g/L)

蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，pH 7.0。

1.3.2 初始发酵培养基( g/L)

蛋白胨12，酵母粉8，NaCl 8，pH 7.0。

1.3.3 碳源补料培养基

葡萄糖60 g/L，配置成一定体积的溶液，每次补加50 mL。

1.3.4 氮源补料培养基

补料I 含蛋白胨12 g，酵母粉8 g，定容至200 mL(分4 次补加，每次50 mL);补料II 含蛋白胨24 g，酵母粉16 g，定容至200 mL(分4 次补加，每次50 mL)。

1.4 实验方法

1.4.1 种子制备

从活化斜面接种1 环菌体至种子培养基中，每100 mL 培养基加入100 μL 的Kanamycin(0.05 g/mL)。在37 ℃，150 r/min 的摇床上培养12 h。

1.4.2 5 L 发酵罐初始培养条件

按3%的接种量将种子液接入装有2.5 L 基础发酵培养基的5 L 发酵罐中，培养温度37 ℃，搅拌速率400 r/min，通气量1.5 L/min，测定发酵液中的溶氧(%);培养过程中取样检测发酵液OD 值，当OD600=0.6 ～0.8 之间时加入诱导剂IPTG(终浓度0.2 mmol/L)，此时调节培养温度至28 ℃。

1.5 分析方法

菌体浓度测定:取适量发酵液，经稀释后，使用紫外可见分光光度计在波长600 nm 下测定光密度。

菌体干重测定:量取25 mL 发酵液，12 000 r/min离心10 min，菌体用生理盐水清洗后再次离心，离心后菌体置于90 ～100 ℃烘箱中烘干至恒重，使用分析天平称重计算菌体干重，菌体干重与吸光值之间的关系为:干重(gDCW/L)=0.327 ×吸光值(Abs)。

残糖测定:采用SBA40E 型生物传感器分析仪进行测定。

转化实验:取1 mL 发酵液，12 000 r/min 离心10 min，去上清液，加入1 mL 150 mmol/L 2-氨基-4-甲硫基丁腈(缓冲体系Tris-HCl，pH 8.0)溶液。使用涡旋振荡器使菌体重悬，将其置于恒温混匀器中进行转化反应，温度40 ℃，转速600 r/min。反应10 min 后加入10 μL 质量浓度36%的浓HCl 终止反应，离心取上清液进行HPLC 检测分析［6－8］。

HPLC 检测方法:日本岛津液相色谱仪;大连伊力特色谱柱:不锈钢填充柱，填料为C18(250 mm ×4.6 mm);流动相:V(甲醇)∶V(水)=25∶75;流速1 mL/min，柱温40 ℃，进样量20 μL，紫外检测波长210 nm。

酶活定义:每分钟催化生成1 μmol 蛋氨酸所需要的菌体量记为1 个活力单位U;每克干菌体所含有的酶活数定义为U/gDCW;每升发酵液所含有的酶活数定义为U/L。

2 结果与讨论

2.1 发酵过程pH 控制对菌体生长和产酶的影响

发酵液的pH 值是发酵过程中的重要参数，pH值的变化影响菌体的生长和目标产物的合成。一般而言，重组大肠杆菌生长的最适pH 为7.0 ～7.2，实验中研究了未控制pH 和控制pH 恒定对菌体生长和产酶的影响。

从图2 可以看出，当未控制pH 进行分批发酵时，最大菌体量为2.57 gDCW/L，比酶活为2 141 U/gDCW;当pH 恒定在7.0 左右进行分批发酵时，重组菌对数生长期有所延长，最大菌体量为3.09 gDCW/L，比酶活为2 241 U/gDCW，分别比未控制pH 进行分批发酵提高了20.23%和4.67%。由此可见，发酵时维持pH 恒定在7.0 左右，对菌体的生长和酶活都有很好的促进作用，所以在后续实验中我们均控制pH 恒定在7.0。

2.2 初始葡萄糖浓度及葡萄糖补加策略对菌体生长和产酶的影响

碳源及其浓度是影响大肠杆菌发酵的关键因素。本实验中选用葡萄糖作为初始碳源，但葡萄糖的添加量过大，菌体生长过于迅速，会产生“葡萄糖效应”，产生乙酸等代谢副产物，既抑制了菌体生长又不利于蛋白的表达［13］，因此使用葡萄糖作为碳源时需要严格控制葡萄糖的浓度。选取葡萄糖的初始浓度为2 g/L、5 g/L、10 g/L 和15 g/L，发酵培养14 h，检测发酵过程中葡萄糖的消耗(图3)及其对菌体生长和酶活的影响(图4)。

结合图3 和4 可以看出，当初始葡萄糖浓度为2 g/L 时，发酵6 h 后，葡萄糖已经耗尽，不能满足生长和产酶的需要;浓度过高(15 g/L)，葡萄糖消耗过快，产生了“葡萄糖效应”，对菌体的生长和酶活都有抑制作用。综合考虑葡萄糖的消耗、菌体的生长以及酶活的高低情况，选择葡萄糖初始浓度5 g/L 较适宜，此时菌体浓度为5.32 gDCW/L，比酶活达2 200 U/gDCW。

当初始葡萄糖浓度为5 g/L 时，分别选取糖浓度下降为2 g/L(图5(a))和3 g/L(图5(b))时进行反馈补料，每次补加50 mL 碳源补料培养基，比较两种不同补料策略对菌体生长和产酶的影响。

图2 pH 控制对菌体生长和酶活的影响(a)未控制pH;(b)控制pH 恒定Fig.2 Effects of pH on strain growth and enzyme activity(a)natural pH;(b)constant pH

图3 不同初始葡萄糖浓度下葡萄糖的消耗情况Fig.3 The glucose consumption under the different initial concentration of glucose

由图5 可知，发酵14 h 后，葡萄糖浓度基本维持在2 ～3 g/L，不再消耗，此时停止补料。结果表明，葡萄糖浓度降为2 g/L 时进行反馈补料，最大菌体量为7.83 gDCW/L，比酶活达2 215 U/gDCW(图5(a));而葡萄糖浓度降为3 g/L 时进行反馈补料，最大菌体量为7.07 gDCW/L，比酶活达2 199 U/gDCW(图5(b))，且补料过于频繁，会增加发酵过程染菌率，影响葡萄糖利用率，碳氮比例增大，菌体生长缓慢，代谢不平衡，因此选择葡萄糖下降为2 g/L 时开始补料。

图4 初始葡萄糖浓度对菌体生长和酶活的影响Fig.4 Effects of initial concentration of glucose on strain growth and enzyme activity

图5 葡萄糖补加策略对菌体生长和酶活的影响(a)2 g/L;(b)3 g/LFig.5 Effects of the fed strategy of glucose on strain growth and enzyme activity(a)2 g/L;(b)3 g/L

2.3 氮源补加策略对菌体生长和产酶的影响

分批补料过程中碳氮比例很重要。若碳氮比过低，菌体大量利用氮源，导致pH 偏高;若碳氮比过高，菌体会在酶的合成期因为缺乏前体物质而产酶减少。Donowan 等［14］发现，氮源补料培养基中同时含有酵母粉和蛋白胨时，重组蛋白稳定且细胞还能利用代谢合成的乙酸。实验中分别选取3 种不同的氮源补加策略，考察其对菌体生长和产酶的影响:(a)初始氮源为蛋白胨12 g/L+酵母粉8 g/L，补加氮源补料培养基I;(b)初始氮源为蛋白胨8 g/L +酵母粉5.4 g/L，补加氮源补料培养基I;(c)初始氮源为蛋白胨4 g/L+酵母粉2.7 g/L，补加氮源补料培养基II，氮源初次补加时间与碳源初次补加时间相同，之后每隔2 h 补加50 mL 氮源补料培养基，共补加4 次，结果如图6 所示。

图6 氮源补加策略对菌体生长和酶活的影响(a)初始氮源为蛋白胨12 g/L+酵母粉8 g/L，补加氮源补料培养基I;(b)初始氮源为蛋白胨8 g/L +酵母粉5.4 g/L，补加氮源补料培养基I;(c)初始氮源为蛋白胨4 g/L +酵母粉2.7 g/L，补加氮源补料培养基IIFig.6 Effects of the fed strategy of nitrogen source on strain growth and enzyme activity

图6 (a)是在初始发酵培养基中继续补加氮源补料培养基I，菌体浓度有了很大的提高，但比酶活却有小幅度的下降。图6(b)与(a)相比，降低了初始发酵培养基中氮源浓度，从而导致碳源的消耗速度增加，菌体的生长速度较原来变慢;补加氮源之后，菌体生长速度明显加快，后期继续补加氮源，整个菌体生长过程和产酶过程延长。图6(c)中由于初始发酵培养基中氮源浓度过低，前期菌体生长速率受到较大抑制，虽后期补加氮源，但整体菌体浓度和最大酶活都较(b)低。综合以上因素，选择(b)作为氮源补加策略。该策略下菌体浓度和酶活都大幅提高，最大菌体量13.68 gDCW/L，比酶活为2 148 U/gDCW，相较于单一补加葡萄糖，菌体量提高了74%。

2.4 诱导时机和诱导剂浓度对菌体生长和产酶的影响

通过碳氮源的分批补料发酵，菌体浓度有了大幅度的提高，但是比酶活有所下降。而诱导时机和诱导剂浓度是影响基因工程菌酶活的重要因素，诱导剂使携带质粒的细胞生长速率显著降低;诱导较早会使菌体和目的蛋白产量降低，而诱导较晚虽然菌体量有所提高，但细胞表达外源蛋白的时间减少。选取发酵时间为2、4、6、8 h 时添加诱导剂，考察其对菌体生长和产酶的影响，结果如图7 所示。

图7 诱导时机对菌体生长和比酶活的影响Fig.7 Effects of induction time on strain growth and enzyme activity

图7 可以看出，在2 ～6 h 范围内，随着起始诱导时间的延后，菌体量和比酶活逐渐增加，发酵6 h 时添加诱导剂，菌体量13.56 gDCW/L、比酶活2 450 U/gDCW，比发酵2 h 时添加诱导剂菌体量、比酶活分别增加了9.97%、15.57%;而8 h 时添加诱导剂虽然菌体量比2 h 时添加诱导剂的菌体量增加了14.35%，比酶活却下降了76.67%。综上所述，选择发酵6 h左右添加诱导剂。

选取诱导剂浓度为0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L，考察诱导剂浓度对菌体生长和酶活的影响，实验结果如图8 所示。

从图8 可以看出，IPTG 浓度在0.1 ～0.6 mmol/L范围内对菌体生长和酶活影响不大;其中IPTG 浓度为0.4 mmol/L 时菌体量与0.2 mmol/L 时相同，但其比酶活提高了8.75%，最大酶活为2 610 U/gDCW，因此选择诱导剂IPTG 浓度为0.4 mmol/L。

图8 诱导剂浓度对菌体生长和酶活的影响Fig.8 Effects of induction concentration on strain growth and enzyme activity

2.5 分批补料发酵稳定性实验

根据以上结果，建立以下发酵工艺:整个发酵过程始终控制发酵液pH 恒定在7.0 左右;初始碳源为葡萄糖5 g/L;初始氮源为蛋白胨8 g/L、酵母粉5.4 g/L;发酵过程中检测葡萄糖的变化，当葡萄糖浓度下降为2 g/L 左右开始每次补加50 mL 碳源补料培养基，发酵过程中维持葡萄糖浓度在2 ～3 g/L 之间;在补加葡萄糖的同时补加氮源补料培养基I，每隔2 h补加50 mL，共补加4 次;发酵6 h 后添加诱导剂IPTG，终浓度为0.4 mmol/L。结果如图9 所示。

图9 分批补料发酵稳定性实验Fig.9 The stability test of fed-batch fermentation

进行3 次验证试验，验证实验的分批补料发酵过程曲线均和图9 保持一致，平均菌体量为13.7 gDCW/L，比酶活2 700 U/gDCW，体积酶活为36 990 U/L，表明前期优化结果具有较好的稳定性和可重复性。

3 结论

本文在5 L 发酵罐内建立了工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-28b-NIT 表达腈水解酶的分批补料培养工艺，考察了碳、氮源补加及诱导剂添加等因素对重组大肠杆菌生长和腈水解酶酶活的影响，通过优化获得菌体量可达13.7 gDCW/L，较优化前提高了4.3倍;比酶活为2 700 U/gDCW，体积酶活高达36 990 U/L，比未优化前提高了5.1 倍，实现了工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT 的高密度培养及腈水解酶的高效表达，对于后续蛋氨酸的生物催化法制备具有重要的意义。

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