琼产艾纳香叶精油的抗氧化和抗菌活性*

唐晖慧，金美东

1(黄山学院旅游学院，安徽 黄山，245021) 2(黄山学院教育科学学院，安徽 黄山，245021)

精油是一种纯天然的、成分复杂并具有良好香气的植物精华成分，通常具有抗菌、抗氧化、抗炎、驱虫和安神等功能活性，被应用于医药、食品、化妆品和医疗美容行业［1-3］。艾纳香(Blumea balsamifera (L． )DC．)为菊科(Asteraceae)植物，广泛分布于中国贵州、云南、广西、海南以及东南亚多个国家［4］。艾纳香在中国南方作为传统民族草药已有悠久历史，医书记载艾纳香具有治疗风湿性关节炎、产后痛风、湿疹、皮炎等疾病［5］。在东南亚，艾纳香常被用来熏蒸沐浴，添加到烟草和茶饮料中，并作为草药用于缓解产后痛风及防治皮肤病等［5］。艾纳香精油在民间被认为是艾纳香的精华所在，因其独特香气和记载的药用作用(消炎、消肿、止痛等)受到香精香料和医疗美容及化妆品行业亲睐。目前，中国、孟加拉和泰国的多位学者研究了中国贵州、云南、广西和泰国、孟加拉产艾纳香挥发油的化学组成和抗菌及驱虫活性［5-10］。这些学者多研究艾纳香挥发油，Bhuiyan 等利用Clevenger装置提取泰国和孟加拉产艾纳香叶精油，并分析其化学组成［5，7］。

我国的海南岛因气候环境适宜艾纳香生长，全岛广泛分布，蕴藏量丰富，海南也成为即贵州之后又一个重要的艾纳香产地。本研究利用GC-MS 分析琼产艾纳香叶精油的化学组成，通过DPPH 自由基清除试验、β-胡萝卜素漂白试验和硫代巴比妥酸法研究其抗氧化活性，通过抑菌圈和最小抑菌浓度2 个指标考察其抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

艾纳香叶，采自海南省五指山，自然阴干进行破碎处理得干艾纳香叶粉末;金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、假丝酵母、黄曲霉，均购于广东省微生物研究所;DPPH、正己烷(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich 公司;C8-C22正构烷烃，美国Accustand 公司;TBHQ、Ve、Vc、β-胡萝卜素、亚油酸、吐温40、AAPH、硫代巴比妥酸、十二烷基磺酸钠、庆大霉素、酵母浸膏、牛肉膏蛋白胨、葡萄糖、NaCl、琼脂条等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

SW-CJ-2C 超净工作台，苏州净化设备厂;Varian 1200L GC/MS-MS 气相色谱质谱联用仪，美国Varian公司;DB-5 弹性石英毛细管柱(30 m ×0．25 mm，0．25 μm)，美国Agilent 公司。

1.2 实验方法

1．2．1 提取艾纳香叶精油

称取50 g 艾纳香叶粉末，置于2 L 蒸馏瓶中，再加入1 L 蒸馏水，使用Clevenger 氏装置通过水蒸气蒸馏法提取精油，蒸馏6 h 后收集装置中的油相。以上试验重复8 次，将每次收得的精油集中并加入无水硫酸钠进行干燥，过滤后得到具有浓郁香气的艾纳香叶精油，得率为0．62%。

1．2．2 艾纳香叶精油主要成分分析

将提取的艾纳香叶精油溶解于正己烷(色谱纯)，配置成浓度为200 μg/mL 待测样，利用GC-MS对其进行分析，确定其主要化学成分及其相对含量。升温程序，初温40 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min;进样口温度250 ℃;载气(He)流速1．0 mL/min。萃取头在进样口于250 ℃解析3 min。质谱条件，电子轰击离子源(EI)，离子源温度200 ℃，电子能量70 eV，发射电流35 μA，检测器电压1000 V，接口温度280 ℃，扫描质量范围50 ～500 amu。

化合物定性采用保留指数和质谱图对照2 种方法。化合物的保留指数是根据其保留时间与C8-C22正构烷烃的保留时间按照保留指数计算公式计算而得;采集到的质谱图与NIST 和Wiley 标准谱库对照，对组分定性，仅报道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鉴定结果。用峰面积归一法计算各化学成分的相对含量。

1．2．3 艾纳香叶精油抗氧化活性研究

1．2．3．1 DPPH 自由基清除试验

通过DPPH 自由基清除率表现艾纳香叶精油的抗氧化活性。配制浓度分别为1、2、4、6、8、10、15、20和40 g/L 的受试样品乙醇溶液。分别取1 mL 受试品溶液与2 mL 浓度为0．1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液混合，立刻于517 nm 处测定吸光度，在避光处静置1 h，再测吸光度，不加样的DPPH 乙醇液为空白样。实验平行测定3 次。自由基清除率按下式计算:

清除率/% = ［( AC(0)－ AC(t)) /AC(0)］× 100

式中:AC(0)，t = 0 时的空白吸光度，AC(t)，测试样在t = 1 h 时的吸光度。

1．2．3．2 β-胡萝卜素漂白试验法

将0．1 mg β-胡萝卜素用10 mL 三氯甲烷于圆底瓶中溶解，加入20 mg 亚油酸和100 mg 吐温40，然后于50 ℃旋转真空干燥。加入50 mL 含氧蒸馏水，在超声波中形成乳化液A。取200 μL 浓度分别为0．1，0．5，1，2，4，6 和8 g/L 的受试样品乙醇液与5 mL乳化A 液于试管中混合，等量乙醇代替作为空白样。在50 ℃保温，于470 nm 测定吸光度。测定平行3次。抗氧化率用下式计算。

式中:AA(120)，测试物在t =120 min 时的吸光度，AC(120)，空白在t=120 min 是的吸光度，AC(0)，空白在t=0 min 时的吸光度。

1．2．3．3 硫代巴比妥酸法

分别取0．1 mL 浓度为10，20，40 g/L 的样品乙醇液与0．5 mL 蛋黄乳浊液混合，加入0．05 mL 的AAPH 自由基溶液(0．07 mol/L)引发脂质过氧化反应。随后即加入1．5 mL 乙酸溶液(20%，pH 3．5)和1．5 mL 浓度为0．8%硫代巴比妥酸液(用11 g/L)十二烷基硫酸钠溶液配制)，振荡均匀。不加精油样品的为空白样。然后于95 ℃水浴保持60 min。冷却后，每个试管中加入5 mL 正丁醇，充分萃取，于1 200 g 离心15 min。倾出有机层在532 nm 处测定吸光度值。测定平行3 次。抗氧化指数AI 用下式计算。

式中:AC，完全氧化空白的吸光度，AT，测试样品的吸光度。

1．2．4 艾纳香叶精油抗菌活性研究

1．2．4．1 菌悬液的制备

将受试细菌菌株按1∶100 接种活化，在固体LB培养基上划线，37 ℃培养24 h 后，挑取单个菌落，接种到液体培养基上震荡培养18 h。采用麦氏比浊法将菌液用液体培养基稀释到合适浓度，本实验中菌液浓度为106CFU/mL。将受试真菌菌株用液体SDA培养基使菌种融化分散，30 ℃培养24 h，在SDA 固体培养基划线培养48 ～72 h。将孢子刮入吐温80 生理盐水溶液作为母液，调整浓度为106CFU/mL。

1．2．4．2 滤纸方法(琼脂扩散法)

滤纸片(6 mm)经灭菌后，分别点上5 μL 精油DMSO 溶液，无菌条件下贴在涂有菌液的固体培养基上，并用DMSO 做空白对照，细菌在37 ℃下培养24 h后测抑菌圈直径，真菌在30 ℃下培养48 ～72 h 后测抑菌圈直径，每种受试物6 次重复。

1．2．4．3 琼脂稀释法

用固体培养基以二倍稀释法对精油进行梯度稀释，稀释成13 个2 倍系列浓度，最后一平皿不加精油作为阴性对照，并用DMSO 做空白对照。最后点上配置的菌悬液。细菌在37 ℃下培养24 h，真菌在30℃下培养48 ～72 h，无明显菌落生长的平皿的精油浓度即为精油的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。试验平行3 次。

2 结果与分析

2.1 琼产艾纳香叶精油的化学成分分析

联合GC-MS 技术对艾纳香叶精油进行分析，通过质谱库检索和保留指数比对分析，检出精油的成分组成见表1。初步定性组分45 种，其中有37 种属于萜类化合物，单萜19 种(48．55%)，倍半萜18 种(39．91%)。在单萜中，萜烯种类最多，共10 种(8．65%);萜醇相对含量最高，6 种总含量达29．95%;其他依次为萜酮2 种(9．64%)，萜酯1 种(0．31%)。在倍半萜中，萜烯种类最多，共10 种，相对含量也最高，达到37．59%;另一类是萜醇8 种(2．32%)。图1 为精油的GC-MS 总离子图。精油的相对含量前 5 位的组分分别是(- )-龙脑(28．45%)、石竹烯(22．98%)、樟脑(9．56%)、α-荜澄茄烯(8．32%)和β-蒎烯(4．32%)。这些组分赋予了艾纳香叶精油浓郁的中药香气，主体表现为樟脑香和草药香气［11］。目前已有多个产地的艾纳香挥发油或精油的化学成分报道，如贵州罗甸产艾纳香挥发油主要含有(-)-龙脑(57%)、石竹烯(8%)和樟脑(5%)［6，10］;广 西 南 宁 产 艾 纳 香 精 油 主 要 成 分 是(-)-龙 脑(12%)、1，8-桉 叶 醇(20%)、石 竹 烯(10%)和樟脑(8%);云南普洱产艾纳香挥发油主要成分是(-)-龙脑(52%)和樟脑(18%)［8］;泰国产艾纳香精油主要成分是(- )-龙脑(25%)和樟脑(20%)［9］;孟加拉产艾纳香精油的主要成分是(-)-龙脑(33%)、石竹烯(8%)、喇叭茶醇(7%)和氧化石竹烯(4%)［7］。本研究中琼产艾纳香叶精油与以上多个产地的艾纳香挥发油或精油比较后发现，琼产艾纳香叶精油中(-)-龙脑相对含量依然是最高的，但并未超过半数，而其石竹烯、α-荜澄茄烯和β-蒎烯的相对含量都是其他挥发油或精油所不具备的高含量，这说明琼产艾纳香叶精油具有主要成分丰富的特点，也可能给其带来独特的活性特征。这些组分已经被报道具有抗氧化和抗菌的等活性，艾纳香叶精油也可能具有这类活性，下面就对艾纳香叶精油的抗氧化和抗菌活性进行初步研究。

2.2 琼产艾纳香叶精油抗氧化活性

抗氧化物主要通过两种机制清除自由基，即氢原子转移(HAT)和电子转移(SET)［12-13］。没有某种单一的测试方法足以评价样品的抗氧化活性，所以需要多种方法应用于样品的抗氧化试验中。通过DPPH自由基清除试验、β-胡萝卜素漂白试验和硫代巴比妥酸法研究琼产艾纳香叶精油的抗氧化活性，同时与商业化抗氧化剂水溶性Vc、VE、TBHQ 比较效果。DPPH 自由基是一种稳定的氮中心的自由基，DPPH 自由基清除能力是一种最常见的衡量化合物抗氧化活性指标，广泛应用于定量测定生物样品和食品等物质的抗氧化能力［14］。DPPH 自由基清除实验属于SET类方法，DPPH 自由基有单电子，当有自由基清除剂存在时，与其单电子配对而使褪色，褪色程度与其接受电子的数量成线性定量关系，因而可用分光光度计快速定量分析［15］。由图2 可知，艾纳香叶精油对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加逐渐增强，在1 ～20 mg/mL 浓度内成线性关系。从表2 发现，Vc、VE和TBHQ 3 种商业化的强抗氧化剂的DPPH 自由基清除能力很高，而且效果接近，IC50在11 ～14 μg/mL;而琼产艾纳香叶精油对DPPH 自由基清除率的IC50为11．26 mg/mL。精油的DPPH 自由基清除能力与强抗氧化剂相比效果差距巨大，但是也表现出了一定的抗氧化活性，可推测电子转移作用机制不是其抗氧化作用的主要机制。

表1 琼产艾纳香叶精油化学成分Table 1 Chemical compounds of essential oil from Qiong B. balsamifera (L.)DC. leaves

图1 琼产艾纳香叶精油的GC-MS 总离子图Fig．1 GC-MS total ion chromatogram of essential oil of Qiong B． balsamifera (L．)DC． leaves

表2 琼产艾纳香叶精油和商业化抗氧化剂的抗氧化作用Table 2 Antioxidant activities of essential oil of Qiong B. balsamifera (L.)DC.leaves and commercial antioxidants

图2 琼产艾纳香叶精油的DPPH 自由基清除率Fig．2 DPPH radical scavenging of essential oil of Qiong Blumea balsamifera (L．)DC． leaves

β-胡萝卜素漂白(BCB)试验主要是评价抗氧化物质在乳化脂质体系中抑制脂质氢过氧化前期的能力，属于HAT 类方法。图3 为采用β-胡萝卜素漂白法测定的琼产艾纳香叶精油抗氧化活性。表2 为几种抗氧化物活性的比较，在脂质体系中醇溶性的VE是公认的强抗氧化剂，在本试验条件下，VE再现出极强的抗氧化性，其半抑制浓度IC50约为0．017 g/L。但是作为强抗氧化剂的水溶性Vc 几乎不显现其抗氧化活性，未能测出其IC50值。这种现象称为脂质体系中的“极性反常”(polar para-dox)，其原因是由于水溶性极性物质在乳化脂质体系中主要集中在水相，而脂相中的浓度极低。琼产艾纳香叶精油在高浓度时也表现出较好的抑制β-胡萝卜素漂白的活性，IC50约为3．55 g/L。与2 种强抗氧化剂比较发现，精油的IC50值与强抗氧化剂之间的差距较DPPH 自由基清除试验缩小，说明精油在脂质体系中表现出更强的抗氧化活性。

图3 琼产艾纳香叶精油的β-胡萝卜素漂白抑制活性Fig．3 BCB inhibition of essential oil of Qiong Blumea balsamifera (L．)DC． leaves

硫代巴比妥酸法(TBARS)主要衡量的是抗氧化剂清除能导致脂质过氧化的自由基的能力，同时也能衡量弱亲脂性抗氧化剂的抗氧化能力，属于HAT 类方法，此法也被认为是最接近真实环境的测试方法。由于水溶性抗氧化剂会出现“极性反常”现象，所以该法仅对琼产艾纳香叶精油和脂溶性的VE、TBHQ进行测试。如表3 所示，精油和其他抗氧化剂的抗氧化指数均随受试浓度的升高而上升，同时还发现精油与VE和TBHQ 的差距并未表现出DPPH 和BCB 试验中巨大的差距。精油表现出的抗氧化活性主要来源于其中萜烯类化合物，如石竹烯等。从3 个测试结果看，精油抗氧化作用机制主要是氢原子转移作用，电子转移作用较弱。虽然精油的抗氧化能力与公认的强抗氧化剂仍存在差距，但是TBARS 结果说明琼产艾纳香叶精油在接近真实环境的体系中表现出了较强的抗氧化能力。可以认为琼产艾纳香叶精油作为一种纯天然产物，具有成为保健食品和化妆品等高档产品中天然抗氧化添加剂的潜力。

表3 琼产艾纳香叶精油和商业化抗氧化剂的硫代巴比妥酸试验Table 3 Essential oil of Qiong B. balsamifera (L.)DC. leaves and commercial antioxidants TBARS

2.3 琼产艾纳香叶精油的抗菌活性

植物精油普遍表现出了抗菌性能，但是不同精油对不同菌种的抑制能力存在差异，需要做详细的研究。选用2 种革兰氏阳性细菌，2 种革兰氏阴性细菌和2 种真菌作为测试菌，通过抑菌圈和最小抑菌浓度(MIC)2 个指标对琼产艾纳香叶精油的抑菌活性进行初步研究。由表4 可知，比较抑菌圈发现精油对革兰氏阳性细菌的抑制效果明显好于阴性细菌，对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强。对真菌的抑制效果略强于细菌，对假丝酵母的抑制能力稍强于黄曲霉。比较MIC 发现精油对真菌的抑制能力明显强于细菌，2种真菌的MIC 都是625 μg/mL，对金黄色葡萄球菌抑制效果较好(625μg/mL)，对其他3 种细菌的抑制能力相对较弱(2 500 μg/mL)。据泰国学者研究发现，泰国产艾纳香精油对革兰氏阴性菌大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌都没有表现出抑菌活性，仅对革兰氏阳性菌蜡样芽孢杆菌(MIC:0．15 mg/mL)和金黄色葡萄球菌(MIC:1．2 mg/mL)及真菌假丝酵母(MIC:1．2 mg/mL)表现出抑菌活性［5］。与其相比，琼产艾纳香叶精油具有更加广泛的抗菌能力，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌都有抑制活性，而且对金黄色葡萄球菌、假丝酵母和黄曲霉具有更强的抑制能力。这种良好表现主要得益于其含有的(-)-龙脑、石竹烯和樟脑，这些物质的抗菌活性已有报道［16-17］，还得益于琼产艾纳香叶精油中各化学组分相对含量较平均，呈现多样性表现，从而表现出广谱抗菌效果。虽然其表现出的抑菌活性远低于庆大霉素的抑菌能力，但作为天然植物精油已算较好的表现。面对使用抗生素易产生耐药性的问题，琼产艾纳香叶精油表现出的抗菌活性说明其是一种很好的天然抗菌剂，可应用于食品和医疗美容等行业。

表4 琼产艾纳香叶精油与抗生素的抑菌活性Table 4 Antimicrobial activities of essential oil and antibiotic

3 结论

通过体外实验对琼产艾纳香叶精油的抗氧化和抗菌活性进行了初步研究。利用水蒸气蒸馏法获得精油，得率为0．62%;经过GC-MS 分析，精油被定性检出化合物45 种，主要是单萜和倍半萜类化合物，相对含量较高的组分是(-)-龙脑、石竹烯、樟脑和α-荜澄茄烯。通过DPPH 自由基清除试验、β-胡萝卜素漂白试验和硫代巴比妥酸法试验发现精油具有较强的抗氧化活性。同时，精油对6 种受试菌都表现出了抑制活性，对金黄色葡萄球菌、假丝酵母和黄曲霉具有较好的抑制能力，对大肠杆菌、李斯特氏菌和沙门氏菌也表现出了抑制活性。从以上抗氧化和抗菌活性看，琼产艾纳香叶精油具有开发成为食品和化妆品天然抗氧化剂及抗菌剂的潜力，应用范围和效果还有待进一步研究证实。

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