SmartAmp快速检测技术及其应用

戚丽华，张传福，史云，胡晓丰，宋宏彬，刘雪林

军事医学科学院 疾病预防控制所，北京 100071

SmartAmp(smart amplification process)技术是日本学者Mitani等于2007年首先报道的一种新的DNA等温扩增技术。根据目标序列设计5条引物，在Aac DNA聚合酶的作用下实现自循环链置换反应，并通过引物上结合的杂交敏感的荧光染料实现对扩增过程的监测[1]。和其他检测方法相比，Smart⁃Amp技术具有快速、精确、灵敏、特异、背景低、成本低等优点[2]，目前在基因多态性分析、感染性疾病诊断，以及食品、环境中病原体快速检测等方面已有初步应用，并显示了很好的应用前景。

1 SmartAmp技术原理

SmartAmp技术的基本原理，即获取目标序列后在等温条件下对其反复进行扩增，并通过荧光实时监测，以检测目标序列的存在。根据目标序列保守区域设计 turnback primer(TP)、forward primer(FP)、boost primer(BP)、outer primer 1(OP1)、outer primer 2(OP2)等共5条引物[3]。TP由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，FP带有一个茎环结构，它们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条DNA单链退火，向对侧延伸。OP1和OP2的退火位点分别位于TP和FP外侧，向中间退火延伸的同时将TP和FP延伸得到的双链剥离。带有TP或FP的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以TP和FP的特殊结构为起点，进行自身引导的DNA合成。这样循环往复，在Aac DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增[4]。在此过程中，其中一条引物上结合一种杂交敏感的荧光引物，一旦与互补序列退火杂交，即可发出一定强度的荧光，由实时荧光定量PCR仪监测。随着扩增反应的进行，荧光强度增大，当超过检测最低阈值时即可确定扩增反应的实现，也即目标序列的存在[1]。整个过程在60℃恒温条件下30～40 min即可完成[3]。

2 SmartAmp技术的优点

SmartAmp技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异。首先，反应使用了5条不对称引物，当DNA链与任何一条引物不匹配时，就会阻止后续的扩增反应。另外反应体系中还加入了错配结合蛋白Taq MutS，如果引物出现单个碱基的错配，Taq MutS即结合到错配区域，使扩增反应停止[5]，不再有荧光产生。SmartAmp的这一特点使得它能够检测出单个核苷酸的差异，从而成为单核苷酸多态性检测的有力方法。这也是与其他等温扩增技术，如环介导恒温扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、解链酶扩增等相比，SmartAmp最为明显的优点。在病原微生物的检测方面，SmartAmp也能够降低其他污染的影响。

SmartAmp技术不需要核酸纯化，在检测过程中使用的Aac DNA聚合酶具有很强的抑制细胞污染物影响的能力，只需要一个简单的热处理使DNA和蛋白质变性(如血样，98℃ 3 min)，即可直接分析临床样品。而PCR所用的Taq DNA聚合酶，极易因样品不纯而受到抑制，必须进行DNA纯化[1]。2009年，Victor等还提出使用一种SmartAmp等温裂解缓冲液(SmartAmp isothermal lysis buffer，SIL-B)，它能够在60℃下溶解血细胞，使DNA变性，这样就可以实现完全的等温扩增[6]。

SmartAmp技术具有较低的背景。在其等温扩增过程中使用的杂交敏感的荧光引物，相当于一种序列特异性染料，一旦与互补序列杂交，引物上的荧光即向实时PCR仪提供信号[1]。它在低背景下显示了很高的信号强度，大大提高了反应的信噪比。检测的特异性和灵敏度也随之增强[7]。

SmartAmp技术与传统的检测基因多态性的方法，如DNA芯片、限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)、等位基因特异性多 PCR(AS-PCR)、Se⁃quenom、TaqMan探针、Invader等相比，具有简单、快速、成本低、灵敏度高等明显优势。它的出现，使得临床上检测基因多态性，而后制定个体化治疗方案、给出相应生活方式建议这一发展趋势更加现实可行[5]，能够极大地促进现代医学的发展。

SmartAmp同样可以用来检测临床样本、食物、环境中的病原体[3,8]。目前常用的病原体检测方法有培养法、噬菌体法、电化学方法、基因芯片、免疫学方法、PCR及同样为等温扩增的LAMP等，与这些方法相比，SmartAmp技术具有快速、简单、成本低等明显优势。各种方法的详细比较见表1。

SmartAmp还可通过一步法对RNA进行扩增，称为RT-SmartAmp，由Kawai等设计并应用于2009年大流行的甲型流感H1N1病毒的快速检测中[3]。只需在反应体系中加入禽骨髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶，即可将RNA反转录和DNA扩增合为一步。

另外，在临床上还可以通过一种连接了电荷耦合相机的数字过程进行检测，使用96孔板或384孔板及自动化分装单元能够显著增加处理量[7]，这样可极大地提高检测效率，进一步降低检测成本。

3 SmartAmp技术的应用

SmartAmp作为一种新的DNA等温扩增技术，由于其具有简单、快速、特异性强、灵敏度高[1,3,5]的特点，目前已在感染性疾病诊断、基因快速筛查、个体化用药等方面得到日益广泛的应用。

3.1 感染性疾病诊断

SmartAmp技术能够用于细菌、病毒等病原体的快速检测。依据其具有识别出单个核苷酸差异的能力，不同型别的菌毒株和耐药的变异菌毒株也都能同时被快速检测出来[6]。日本学者Kawai等在2009年将一步法RT-SmartAmp技术运用到当年大流行的甲型流感H1N1病毒的检测中[3]，并与广泛使用的流感快速诊断试验进行了比较，显示SmartAmp方法在疾病早期即能检出病毒，可同时区分2009年甲流毒株H1N1和季节性H1N1毒株，并且灵敏度高，有较好的特异性，是用于临床H1N1流感病毒快速检测的有效手段。

表1 病原体不同检测方法比较

3.2 快速基因筛查

我们知道肥胖、心脏疾病、慢性炎性疾病等与患者的基因多态性有关，SmartAmp技术可以分析这些基因标志，临床的起始材料可以是血样、口腔拭子或指甲屑等。一旦知道了基因标志，SmartAmp技术就是一种非常简单、准确度高、成本低的快速基因筛查方法[8]。目前将SmartAmp技术应用到此方面的研究相对较多[19-22]，如2009年Toyoda等用此方法分析发现了ABCC11基因野生型538G的等位基因538G＞A和耳垢类型、腋臭、肺癌风险有关[19]；2011年，Azuma等利用此方法对人CYP2A6基因进行了分型，这种基因的多态性被认为是日本男性吸烟者发生烟草相关肺癌的决定性因素[22]。

3.3 指导个体化用药

患者的遗传学特征可决定机体对于药物和临床治疗的反应。检测患者疾病相关基因的多态性，而后据此制定个体化治疗方案，是现代医学的发展方向[6]。然而，目前多数检测技术因为分析速度慢、成本高而在临床应用上处在瓶颈期。SmartAmp作为一种廉价快速的技术，对此领域起到了极大的推动作用[23-24]。例如，2009年Mitani等用此方法分析了CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G＞A基因的携带情况，这3种基因的多态性对华法林(一种广泛使用的抗凝血药)的药代动力学有重要影响，对它们进行分析有助于指导调整临床用药剂量[5]。2010年，Okada等对血样进行了谷胱甘肽S-转移酶M1、T1的分型，为临床上评估与此相关的药物诱发肝脏毒性的易感性提供了帮助[25]。又如，ABCC4基因中携带2269G＞A等位基因的患者使用含硫代嘌呤药物容易诱发造血系统毒性，携带此等位基因的患者须相应地减少此类药物的使用。2011年Aw等用此方法检测了279名日本患者该等位基因的携带情况，指导了临床用药[23]。以上这些研究均证实了SmartAmp技术用来分析基因多态性的有效性。2008年Tatsumi等用SmartAmp技术检测了原癌基因第12个密码子的变异，以快速检测胰腺癌的微小转移灶，检测在60 min内完成，据此指导化疗，能够在很大程度上改善预后[26]。

4 SmartAmp技术的发展前景

SmartAmp作为一种新的DNA等温扩增技术，自2007年开发以来，已在个体化治疗、快速基因筛查、感染性疾病诊断等领域中显现出了其实际应用价值，并证明了其具有操作简便、用时少、成本低、灵敏度高、特异性强、能够抑制背景影响等优势。而在食物、环境中病原体检测方面，虽然尚未见相关研究报道，但SmartAmp方法的原理同样适用，再加上其独特的优点，使得它在这一领域也呈现出广阔的应用前景。随着相应试剂盒的开发，SmartAmp技术有望成为一种简易快速的常规检测手段，具有广阔的市场潜力。

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