化学物质衍生-同步荧光法测定注射液中γ-氨基丁酸的含量

赵燕燕，王艳，刘丽艳，孙汉文

(1.河北大学 医学实验中心，河北 保定 071000；2.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002)

化学物质衍生-同步荧光法测定注射液中γ-氨基丁酸的含量

赵燕燕1,2，王艳2，刘丽艳1，孙汉文2

(1.河北大学 医学实验中心，河北 保定 071000；2.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002)

采用化学物质衍生结合同步荧光法，建立一种检测注射液中γ-氨基丁酸含量的方法.对γ-氨基丁酸的衍生产物进行同步荧光扫描，考察了影响体系荧光强度的因素.最佳实验条件为：8.0×10-3mol/L硼砂缓冲液(pH=9.6)，1.0×10-5mol/L邻苯二甲醛-2.86×10-5mol/Lβ-巯基乙醇组合试剂为衍生试剂，衍生时间60 min，激发光、发射光通带宽度为5.0 nm，λem=455.0 nm，Δλ=120.0 nm，检测液温度小于25 ℃.结果表明：在上述条件下获得的同步荧光光谱峰形最好，荧光强度最大.γ-氨基丁酸的线性范围为2.50～50.00 μg/L，相关系数为0.999 0，检测限为0.79 μg/L.本方法灵敏度高，操作简便，成本低，可用于注射液中γ-氨基丁酸含量的检测.

化学物质衍生；同步荧光法；注射液；γ-氨基丁酸含量；测定

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA，也称氨酪酸)是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，是一种非蛋白质组成的氨基酸[1].γ-氨基丁酸可以通过其受体发挥各种生理功能(镇痛、抗惊厥、降血压、调节激素的分泌)，其含量与心律失常、癫痫等疾病的发生密切相关.γ-氨基丁酸能增强葡萄糖磷脂酶的活性，促进脑细胞的代谢,临床上用于脑血管障碍引起的偏瘫、记忆障碍、语言障碍、儿童智力发育迟缓等，亦能降低血氨，用于治疗各种类型的肝昏迷等[2].临床上所用的剂型主要是注射液，目前γ-氨基丁酸的检测方法主要有氨基酸分析仪法[3]、色质联用法[4]、高效液相色谱法[5-7]、毛细管电泳法[8-9]、薄层扫描法[10]等.氨基酸分析仪法、色质联用法仪器比较昂贵；高效液相色谱法操作相对复杂；毛细管电泳法重现性差；薄层扫描法容易受环境因素的影响.本实验利用传统的化学物质衍生结合同步荧光法，选用合适的波长差进行同步荧光扫描，使光谱简化，谱带变窄，并对测定条件进行优化，使灵敏度提高，操作简便，成本低，重现性较好，可用于制剂中γ-氨基丁酸含量的检测.

1 实验部分

1.1仪器与试剂

RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司)；DELTA-320型酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；SIM-F140型制冰机(日本三洋设备有限公司)；CU-600型电热恒温水槽(上海-恒科技有限公司);超纯化水机(重庆颐洋企业发展有限公司).

GABA对照品(美国Sigma公司)；γ-氨基丁酸注射液(北京紫竹药业有限公司，规格5 mL:1g)；邻苯二甲醛(OPA)、β-巯基乙醇(β-MCE)和2、4-二硝基氯苯(CDNB)均购自天津市光复精细化工研究所；甲醇、乙腈、硼砂、硼酸、磷酸二氢钾、冰乙酸、磷酸、浓盐酸、氢氧化钠均为分析纯；水为二次去离子水.

GABA对照品储备液配制：精密称取GABA对照品，置于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配制浓度为0.01 mol/L的储备液，于4 ℃冰箱保存，使用时逐级稀释至所需浓度.

OPA储备液配制：精密称取OPA 0.013 4 g置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制浓度为2.0×10-3mol/L的储备液，于4 ℃冰箱保存，使用时稀释至所需浓度.

β-MCE储备液配制：精密量取β-MCE 50 μL置于50 mL容量瓶中，加入适量水混匀，加水定容至刻度，得到浓度为0.014 3 mol/L的储备液，于4 ℃冰箱保存，使用时稀释至所需浓度.

邻苯二甲醛-β-巯基乙醇(OPAME)组合试剂配制：分别量取OPA储备液2.5 mL、β-MCE储备液1 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到含有OPA和β-MCE浓度分别为1.0×10-4mol/L和2.86×10-4mol/L的组合试剂，每天新鲜配制，于4 ℃冰箱保存，作为衍生试剂.

CDNB衍生试剂储备液配制：精密称取2、4-二硝基氯苯0.202 6 g置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，配制浓度为0.04 mol/L的储备液，于4 ℃冰箱保存，使用时稀释至所需浓度.

1.2实验方法

取2支10 mL具塞比色管，标号1，2，向1号管中依次加入1.0 mL衍生试剂，2.0 mL 0.04 mol/L硼砂(pH=9.6)缓冲溶液，1.2 mL含GABA待测溶液，用水定容至刻度，摇匀，室温下避光静置60 min后，在激发光、发射光通带宽度为5.0 nm，Δλ=120.0 nm，λem=460.0 nm的条件下，采用同步荧光法测定荧光强度(F)；向2号管中加入1.2 mL水代替GABA待测溶液，其余均按上述方法处理，作为空白溶液，测定荧光强度(F0)，求得相对荧光强度(ΔF)：ΔF=F-F0.

1.3样品处理

精密量取GABA注射液0.2 mL于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作为供试品储备液，于4 ℃冰箱中保存.精密量取0.2 mL供试品储备液于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到质量浓度为12.80 μg/L的待测样品溶液.

2 结果与讨论

2.1激发波长和发射波长的选择

邻苯二甲醛-β-巯基乙醇(OPAME)组合试剂本身在碱性条件下具有一定的荧光，加入GABA后，由于邻苯二甲醛-β-巯基乙醇组合试剂与GABA发生反应，而产生一种新的荧光产物，反应机理见式1.这种荧光产物的荧光光谱与空白溶液的荧光光谱相似，且位置重叠.只是加入GABA后，体系的荧光强度显著增强，且随GABA加入量的增加，荧光强度呈线性增强.在实验中，求其相对荧光强度，以扣除空白溶液的影响.体系的荧光光谱见图1.

式1 反应机理

按“1.2”所述实验方法，对GABA对照品进行衍生后，先固定激发波长λex=338.0 nm，在390.0～500.0 nm波长内，更换不同波长作为发射波长，测其荧光强度，取荧光强度值最大的波长作为发射波长λem=460.0 nm；固定发射波长，在280.0～400.0 nm波长内，更换不同波长作为激发波长，测其荧光强度，同样取荧光强度值最大的波长作为激发波长λex=340.0 nm.经邻苯二甲醛-β-巯基乙醇组合试剂衍生后GABA的激发光谱和发射光谱见图2.

c(GABA)/( mol·L-1)：1.0；2.3.0×10-8；3.6.0×10-8；4.9.0×10-7；5.1.2×10-7；6.1.6×10-7；7.2.0×10-7.

1.激发光谱；2.发射光谱.

2.2同步荧光光谱及波长差(Δλ)的选择

2.2.1 同步荧光光谱

同步荧光光谱通常指恒(固定)波长同步荧光光谱，是通过固定发射波长和激发波长的间隔Δλ(Δλ=λem-λex)，同时扫描激发和发射2个单色器波长，由测得的荧光强度信号(F)与对应的激发波长(λex)或发射波长(λem)作图得到的光谱图.与常规荧光光谱法相比，同步荧光光谱法具有光谱简化、光谱重叠减少、谱带变窄和散射光减小的优点.在同步荧光光谱中，GABA衍生产物的荧光光谱谱带明显变窄且荧光强度增高.体系的同步荧光光谱与常规荧光光谱见图3.本实验采用同步荧光光谱法.

2.2.2 波长差(Δλ)的选择

实验考察了同步荧光法中不同波长差对体系荧光强度的影响.以λex=220.0 nm为扫描激发波长的起点，在波长差Δλ=10.0～160.0 nm内，每隔20.0 nm对GABA衍生产物的激发波长和发射波长进行同步荧光扫描.结果表明，荧光强度随着Δλ的增大而增强，荧光峰逐渐红移，当Δλ=120.0 nm时，荧光强度达到最大且荧光光谱峰形最好.当Δλ>120.0 nm时，荧光强度降低，半峰宽增大，不同波长差的同步荧光光谱见图4，不同波长差对体系荧光强度的影响见图5.本实验选择Δλ=120.0 nm作为固定波长差.

1.Ex=344.0 nm时，GABA衍生产物的荧光光谱；2.Δλ=120.0 nm时，GABA衍生产物的同步荧光光谱.

1.Δλ=10.0 nm；2.Δλ=30.0 nm；3.Δλ=50.0 nm；4.Δλ=70.0 nm；5.Δλ=90.0 nm；6.Δλ=100.0 nm；7.Δλ=120.0 nm；8.Δλ=150.0 nm；9.Δλ=160.0 nm.

2.3 OPAME组合试剂稳定性考察

配制OPAME组合试剂，放置，每隔一定时间取样测定其荧光强度，考察OPAME组合试剂放置时间对其稳定性的影响.OPAME组合试剂放置时间对稳定性的影响见图6.结果表明，OPAME组合试剂本身的荧光强度在24 h内能保持稳定，24 h后，随着放置时间的延长，荧光强度显著下降，由于稳定性问题，在实验过程中，OPAME组合试剂要在配好后24 h内使用.

图5 不同波长差对体系荧光强度的影响

图6 OPAME组合试剂放置时间对其稳定性的影响

2.4影响体系荧光强度的因素考察

2.4.1 通带宽度对相对荧光强度的影响

配制一定浓度的GABA对照品溶液，按“1.2实验方法”操作，在不同的激发光和发射光通带宽度条件下扫描同步荧光光谱.结果表明:荧光强度和背景干扰均随通带宽度的增加而增强，为了提高灵敏度同时降低背景干扰，选用激发光，发射光通带宽度均为5.0 nm.

图7 衍生时间对GABA衍生物相对荧光强度的影响Fig.7 Effect of derivative time on the relative fluorescence intensity of GABA derivative

2.4.2 衍生时间对相对荧光强度的影响

本实验考察了衍生时间对体系相对荧光强度的影响.按“1.2实验方法”每隔10 min同时测定空白溶液和GABA衍生物的荧光强度，求得相对荧光强度.结果表明:相对荧光强度随着衍生时间的增加逐渐增强，当衍生时间为60 min时，相对荧光强度达到最大；衍生时间大于60 min，相对荧光强度逐渐降低.衍生时间对相对荧光强度的影响见图7.本实验选择的最佳衍生时间为60 min.

2.4.3 衍生试剂的种类和用量对相对荧光强度的影响

本实验考察了OPA,β-MCE，OPAME组合试剂、CDNB 4种衍生试剂对体系相对荧光强度的影响.结果表明，CDNB和β-MCE衍生GABA后，没有荧光产物生成，OPA衍生GABA的效果不显著，OPA作为衍生试剂的同步荧光光谱见图8.将OPA和β-MCE按照一定比例混合作为组合试剂时，荧光强度显著增大.OPAME组合试剂作为衍生试剂的同步荧光光谱见图9.

同时，考察了OPAME组合试剂中OPA和β-MCE的浓度和用量对体系相对荧光强度的影响.结果表明，相对荧光强度随着OPA浓度的增大而增加，当OPA浓度为1.0×10-5mol/L时，相对荧光强度达到最大，继续增大OPA的浓度，相对荧光强度不变，当OPA的浓度大于1.0×10-5mol/L时，相对荧光强度逐渐降低，说明OPA的浓度过大，不利于衍生反应进行.OPA的浓度对相对荧光强度的影响见图10.β-MCE的浓度为2.86×10-5mol/L时，体系的相对荧光强度最大，β-MCE的浓度对相对荧光强度的影响见图11.本实验选择组合试剂中OPA和β-MCE的浓度分别为1.0×10-5mol/L和2.86×10-5mol/L.

1.OPA的空白本底；2.OPA衍生GABA的荧光光谱.

1.OPAME组合试剂的空白本底；2.OPAME组合试剂衍生GABA的荧光光谱.

图10 组合试剂中OPA的浓度对相对荧光强度的影响

图11 组合试剂中β-MCE的浓度对相对荧光强度的影响

2.4.4 缓冲体系种类、pH和用量对相对荧光强度的影响

本实验考察了硼砂、磷酸二氢钾、伯瑞坦-罗宾森(BR)等3种缓冲溶液以及pH对体系相对荧光强度的影响，各缓冲溶液pH值对相对荧光强度的影响见图12.结果表明，硼砂缓冲体系在pH=9.6时，稳定性最好，相对荧光强度最大，背景干扰较小.同时考察了硼砂缓冲液的浓度对体系相对荧光强度的影响.当硼砂缓冲液的浓度为8.0×10-3mol/L时，相对荧光强度最大，硼砂缓冲溶液(pH=9.6)浓度对相对荧光强度的影响见图13.本实验选择8.0×10-3mol/L硼砂溶液(pH=9.6)作为缓冲液.

图12 各缓冲溶液pH值对体系相对荧光强度的影响

图13 硼砂缓冲溶液浓度对相对荧光强度的影响(pH=9.6)

2.4.5 待测溶液温度对相对荧光强度的影响

本实验考察了0～60 ℃不同温度对待测溶液体系相对荧光强度的影响.结果表明:当溶液温度在0～25 ℃时，体系的相对荧光强度比较稳定，继续增大溶液的温度，体系的相对荧光强度逐渐下降，溶液温度对相对荧光强度的影响见图14.本实验选择待测溶液温度在低于25 ℃条件下进行.

图14 待测溶液温度对体系相对荧光强度的影响

2.5样品分析

2.5.1 线性关系和检出限

配制一系列不同浓度的GABA标准溶液，按“1.2实验方法”进行衍生测定，以相对荧光强度(ΔF)对浓度(c)作图，得到工作曲线方程为

ΔF=94.80+1.35×107c，(r=0.999 0)

方程的线性范围为2.50～50.00 μg/L.

按照IUPAC(36)的规定，由公式D=3×δ/k(δ为11份空白溶液荧光强度标准差,k为工作曲线斜率)，计算检出限为0.79 μg/L.

2.5.2 精密度实验

取6份已知浓度对照品溶液，按“1.2”所述实验方法进行处理，在已建立的荧光条件下进行测定，得到GABA的含量，其RSD值为1.86%.

2.5.3 稳定性实验

将已处理好的待测样品溶液于25 ℃条件下放置，每隔5 min取样，在已建立的荧光条件下进行测定，GABA衍生产物在20 min内保持稳定，其RSD值为2.09%.

2.5.4 回收率

分别取已知浓度的待测样品溶液9份，分别加入相当于其中GABA含量80%，100%，120%的对照品溶液各3份，按“1.2”所述实验方法进行处理，在已建立的荧光条件下进行测定.结果见表1.

表1 注射液中GABA的加标回收率(n=3)

2.5.5 实际样品测定

按“1.3”项下方法配置供试品溶液3份，按“1.2”项下实验方法进行衍生，按已建立的方法进行测定.测得GABA注射液中GABA的含量占标示量的96.75%，RSD值为2.18%.

3 结论

将邻苯二甲醛-β-巯基乙醇组合试剂衍生和同步荧光法结合起来用于制剂中GABA的测定，并进行了条件的优化，获得了良好的结果.该方法准确度较高，操作简单，检测限低，可用于注射液中γ-氨基丁酸含量的检测.

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Contentofγ-aminobutyricacidininjectionbychemicalsderivative-synchronousfluorescencespectroscopy

ZHAOYanyan1,2,WANGYan2,LIULiyan1,SUNHanwen2

(1.Experimental Center of Medicine, Hebei University, Baoding 071000, China;

2.College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China)

A chemicals derivative-synchronous fluorescence method for determination of the content ofγ-aminobutyric acid in injection has been described.The ramification ofγ-aminobutyric acid has been synchronous fluorescence scanned to examine the factors which affect the intensity of systematic fluorescence.The optimum experiment conditions: 8.0×10-3mol/L borax buffer solution at pH=9.6, the combination reagents of 1.0×10-5mol/L OPA-2.86×10-5mol/Lβ-MCE were derivatization reagent，the derivative time was 60 min.The band-pass width of Ex,Emwere 5.0 nm，λem=455.0 nm，Δλ=120.0 nm，The temperature of the solution under test was Less than 25 ℃.The results showed that the peak shape was the best and the fluorescence intensity was maximum gained under these conditions by the synchronous fluorescence spectra.The linear ranges were 2.50 ～50.00 μg/L (0.999 0) forγ-aminobutyric acid.The detection limit ofγ-aminobutyric acid was 0.79 μg/L.The method which had high sensitivity, easy operations and low costs could be used to determine the content ofγ-aminobutyric acid in injection.

chemicals derivative; synchronous fluorescence spectroscopy; injection; the content ofγ-aminobutyric acid; determination

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.01.008

2012-09-14

河北省教育厅科学研究计划项目(2009315)；河北省卫生厅医学科学研究重点课题计划项目(20090570)

赵燕燕(1960-)，女，天津人，河北大学教授，硕士生导师,主要从事药学以及将现代分离技术用于临床、药学、食品、环境等方面的研究工作.E-mail:zhaoyany606@tom.com

孙汉文(1945-)，男，河北魏县人，河北大学教授，博士生导师.主要从事药物分析方面的研究.

E-mail:hanwen@hbu.edu.cn

O657.3

A

1000-1565(2013)01-0035-07

(责任编辑梁俊红)