茶叶中阿维菌素和吡虫啉残留量的测定

2013-10-27

分析仪器 2013年4期

(中国热带农业科学院农产品加工研究所，湛江524001)

1 前言

吡虫啉(imidacloprid)又叫灭虫精，是新一代硝基亚甲基类内吸杀虫剂[1]，具有广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，并有触杀、胃毒和内吸多重药效。吡虫啉近年在我国茶叶种植生产中应用十分广泛,主要用以防治小绿叶蝉、黑刺粉虱等刺吸式口器害虫。阿维菌素(abamectin)是由放线菌产生的一种安全、高效、广谱的大环内酯类抗生素[2,3]，广泛用于葱、西兰花、甘蓝等出口蔬菜和茶叶上。在14、25和35℃下吡虫啉在油菜叶面消解的半衰期分别为8.7、3.8和2.9天[4]，推荐使用剂量、2倍推荐使用剂量和4倍推荐使用剂量使用后阿维菌素在广州小白菜中的半衰期为1～2d[5]。按世界卫生组织(WHO)的5级分级标准，阿维菌素属于高毒化合物。欧盟法规(EC)规定了茶叶中阿维菌素和吡虫啉的最大残留限量(MRL)分别为0.02 mg /kg和0.05mg /kg，日本则不允许将阿维菌素用于茶叶种植中，日本肯定列表中茶叶中的限量标准为10 mg/kg。然而，随着我国茶叶出口量逐年增长，为应对国际贸易壁垒，急需建立同时检测吡虫啉和阿维菌素的高灵敏度方法。

目前，食品中吡虫啉的测定方法的主要有液相色谱法[6-10]和气质谱联用法[11]，阿维菌素的测定方法主要是高效液相色谱荧光法[12,13]和高效液相色谱紫外法[14,15]。以往的方法灵敏度低，无法跟国际接轨。本方法的建立旨在建立一个同时测定茶叶中吡虫啉和阿维菌素的测定方法。目标物经乙腈提取，氨基炭黑柱净化，采用超高效液相色谱串联质谱方法同时测茶叶中吡虫啉和阿维菌素的残留量。方法灵敏度高，分析速度快。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

Waters ACQUITY UPLCTM-TQD MS/MS系统(美国waters)；高速匀质机(德国IKA)；氮吹仪(美国Organomation)；离心机(日本日立)；漩涡混合器(德国IKA)；电子天平(FA1104，上海天平仪器厂)等。

阿维菌素标准品；吡虫啉标准品(95%)；乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；乙腈(分析纯)；固相萃取小柱：氨基炭黑柱(500 mg/6 mL)；水为二次蒸馏水。

2.2 标准溶液的配制

精密称量50.0 mg阿维菌素和吡虫啉原药于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇(色谱纯)溶解并定容，配制成500 mg/L的标准储备液。

2.3 标准曲线

取阿维菌素和吡虫啉标准储备液，分别用甲醇稀释配制成5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL的标准工作溶液，经液相色谱测定后建立两种目标物浓度与峰面积的回归方程。

2.4 色谱质谱条件

色谱柱：UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；采用乙腈和0.005 mol/L乙酸铵溶液梯度洗脱，洗脱程0～1 min,20%A;1～4 min,90%A;4～5 min,100%A;5～7 min,20%A。流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃ ；进样量：10 μL离子源：ESI，正离子模式；毛细管电压：4.0 kV ；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量：800 L/ hr；锥孔反吹气流量50 L/ hr；锥孔电压：40 v；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子对：吡虫啉，256/175.1(定量离子对)，256/209；阿维菌素，890.5/305.2(定量离子对)，890.5/567.3。

2.5 分析步骤

2.5.1 提取

准确称取2.5 g(精确至0.01 g)均匀试样，用5 mL水将试样润湿，放置5 min,加入5 g无水硫酸钠和15 mL乙腈，涡动3 min，超声5 min，5000 r/min离心5 min，将上清液转移至浓缩瓶中。用10 mL乙腈再提取一次，合并提取液。将提取液于50 ℃水浴下用旋转蒸发仪浓缩至近干，在残渣中加入2.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液，备用。

2.5.2 净化

将炭黑氨基柱用4.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)预条件化，加入上述待净化溶液，用10 mL具塞试管收集，用2.0 mL甲醇+二氯甲烷溶液(5+95)洗浓缩瓶后淋洗小柱，重复一次。将收集溶液置于50 ℃水浴中用氮气吹干，残渣用1.0 mL乙腈溶解，在漩涡混合器上混匀，过0.2 μm微孔水相滤膜后于高效液相色谱测定。

3 结果与讨论

3.1 工作曲线

用流动相将混合标准溶液稀释成5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500ng/mL，以峰面积为纵坐标，目标化合物的浓度为横坐标，绘制标准曲线。阿维菌素和吡虫啉的相关系数分别为R=0．9991和R=0．9985，回归方程分别为y=2632x+1033和y=8150x+229，在5 ng/mL～500 ng/mL范围内，阿维菌素和吡虫啉工作曲线线性良好，适合定量分析。混合标准溶液离子流图见图1和图2。

图1 吡虫啉标准溶液的离子流图

图2 阿维菌素标准溶液的离子流图

3.2 液相色谱、质谱测定条件的优化

阿维菌素和吡虫啉的极性较弱，在反相色谱柱上的保留较强，因此选择较高比例的乙腈作为强洗脱溶剂。母离子扫描显示：阿维菌素和吡虫啉在正离子模式下，目标物检测离子以[M+NH4]+形式存在的量较多，在流动相中加入5 mmol/ L乙酸铵可促进母离子的形成。两种化合物的保留时间、定量离子、定性离子、锥孔电压及碰撞能量见表1。

表1 各目标化合物的检测离子及质谱采集参数

3.3 净化条件的选择

由于茶叶中色素含量较高，所以选取了可以有效吸附色素的色谱柱。结果表明，炭黑氨基柱可以很好的吸附色素和其他杂质，同时，选用合适的洗脱液完全可以将两种化合物洗脱，从而获得较高的添加回收率。普通的氨基柱也可获得较高的添加回收率，但由于不能吸附提取液中的色素，从而增加了对分析柱的污染及对仪器响应的干扰，而选用碱性氧化铝柱和C18 SPE柱时不论选择哪种淋洗剂，回收率均小于60%。所以最终选用炭黑氨基柱。淋洗液选用甲醇和二氯甲烷，对二者比例进行了优化，当甲醇和二氯甲烷的比例在1∶99到5∶95之间，回收率均能满足要求，当甲醇和二氯甲烷的比例为5∶95时，回收率达到最大值。

3.4 检出限

联合国粮食与农业组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)均未制定最高允许残留限量，加拿大和澳大利亚规定油菜籽中最高残留限量为0.05 mg/kg。联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO)所属的食品中农药残留立法委员会(CCRPF)规定了阿维菌素的每日允许摄入量0.1 μg/kg·bw，阿维菌素的最高残留限量(MRL)为5 μg/kg，美国农业部下属的食品安全检验局(FSIS)规定的MRL值为20 μg/kg，欧盟规定MRL值为0.02 mg/kg。加拿大卫生部发布EMRL2012-45号通报，有害生物管理局修订了吡虫啉的最大残留限量。将吡虫啉在蛋、猪、马、牛、绵羊、山羊、家禽的脂肪、肉以及肉副产品中的最大残留限量修订为0.02×10-6，将吡虫啉在干黄豆和奶类中的最大残留限量分别修订为3.5×10-6和0.03×10-6。本方法的最低检出限为0.001 mg/kg，完全适合于进出口农产品中阿维菌素和吡虫啉的残留检测。

3.5 方法的准确度与精确度

用上述试验方法，在样品中添加不同水平的阿维菌素和吡虫啉混合标准溶液，进行添加回收率试验，分别进行了5 μg/kg、20 μg/kg和100 μg/kg三个添加水平的两种目标化合物的加标回收实验，每个水平重复测定6次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表2。从表2可以看出，平均回收率范围为81.4%～95.8%，RSD分别为2.0%～8.5%。

3.6 应用

该方法已应用于茶叶中阿维菌素类药物残留的检测。在对购自湛江市场的5份绿茶、5 份红茶、5份普洱茶的检测中,只有其中一份绿茶检测出10.4μg/kg的吡虫啉。

4 结论

本文建立了茶叶中阿维菌素和吡虫啉的超高效液相色谱-串联质谱方法。通过对提取与净化方式进行探讨与优化,在一定程度上减少了茶叶基体对检测的干扰。采用电喷雾电离源,在含有乙酸铵缓冲液的流动相条件下,以选择信号强且稳定的[M+NH4+]加合离子峰作为母离子,以基质校正曲线进行定量。方法稳定、可靠、灵敏,能够满足国内外法规对茶叶中阿维菌素和吡虫啉残留的限量要求,可用于茶叶中阿维菌素和吡虫啉两种农药残留的检测与确证。