慢性阻塞性肺疾病各期抗M2受体抗体mRNA表达水平及机理分析

张 伟，姚玉强，谷明明，孙璐璐，韩 佳

(1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011；2.山东中医药大学，山东 济南 250014)

慢性阻塞性肺疾病各期抗M2受体抗体mRNA表达水平及机理分析

张 伟1，姚玉强2*，谷明明2，孙璐璐2，韩 佳2

(1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011；2.山东中医药大学，山东 济南 250014)

目的：通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)不同时期大鼠模型组的抗M2受体抗体mRNA表达水平、心肌细胞的病变程度，来分析COPD在不同分期对心脏的影响。方法:健康雄性Wistar大鼠32只，随机分为4组(正常组A、COPD组B、COPD急性加重组C、COPD并发肺心病组D)。通过气管内滴入脂多糖和被动吸烟的方法建立COPD大鼠模型，COPD模型大鼠再次气管滴入LPS造成急性加重,在COPD的基础上尾静脉注射三氯化铁建立COPD并发肺心病模型。RT-PCR法检测血中抗M2受体抗体mRNA含量，电镜观察心脏结构变化。结果:抗M2受体抗体mRNA在B、C组表达均升高(P<0.05)，在D组表达最高，较AB组均有明显增高(P<0.01)，电镜下心组织损伤程度依次明显,抗M2受体抗体mRNA的表达水平与在电镜下观察的心肌细胞损伤程度有相关性。结论：M2受体抗体在大鼠COPD并发肺心病模型组中最高，表明COPD病程后期继发肺心病与对M2受体的自身免疫密切相关。大鼠心肌细胞病理改变程度与M2受体抗体mRNA表达水平相关，提示抗M2受体抗体对COPD病程中心脏病变的发生与发展具有重要作用。

慢性阻塞性肺疾病;抗M2受体抗体mRNA;大鼠

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以不完全可逆性气流受限及气道持续性炎症为特征的疾病，呈进行性发展，临床上以进行性呼出气流减少、呼气末容量增大、低氧血症、高碳酸血症和进行性肺动脉高压为特征。属于中医学“肺胀”“喘证”“咳嗽”“痰饮”等范畴，临床表现为咳、痰、喘、胸部胀闷等。肺心病是COPD的常见转归，在COPD的病理生理过程中，由于炎性因子或介质、血管内皮、血小板、黏附因子的作用，导致COPD患者肺动脉高压，引起心功能损害，结构改变，引起右心衰竭。近几年的研究表明，在慢性阻塞性肺疾病发病过程中，心脏主要受体的功能有明显的变化，并发现循环血中免疫复合物增加与心功能异常有相关性。[1]这些提示在COPD的发病过程中，可能也有心脏受体抗体的免疫学机制参与，最终导致肺心病的形成。本研究在实验室中模拟制作COPD不同时期的大鼠模型，通过检测各模型组的抗M2受体抗体mRNA的表达水平，并观察心、肺组织病理改变，揭示COPD发病过程中与心肌损害程度的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠(山东大学提供，许可证号SCXK鲁20090001)32只，体质量(200±20)g。饲料为标准块料(山东中医药大学提供)，饲养在20～25 ℃，湿度40%的动物房内，自由摄食饮水。

1.2 试剂仪器 脂多糖(LPS)(美国Sigma公司)三氯化铁FeCl3(济南星联星科技有限公司)，RT-PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，烟熏箱(100cm×80cm×50cm)及烟熏装置(自制)，指定品牌香烟，水合氯醛(山东大学齐鲁医院，批号：20120209)，匀浆机(IKAwoks，型号：T25basic)，电子天平(梅特勒-托利多(常州)称重设备系统有限公司,型号：APA6000F)，光镜病例图像分析(OLYMPCIS，型号CX-32rfl)，PCR扩增仪(ABI公司,型号：7300，软件：7300SystemSDSsoftware)，冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂，型号:TGL-16B)，70 ℃水浴箱(杭州奥盛，型号：K10CD)，电子显微镜(日本电子，型号JEM-1200EX)，图像处理系统(美国GATAN)。

1.3 方法

1.3.1 模型建立 用随机数字表法将大鼠随机分为4组：正常组(A)、COPD组(B)、COPD急性加重组(C)，COPD合并肺心病组(D)，每组8只，雄性。适应性喂养3d。第1,14天大鼠麻醉后气管内滴LPS0.2mL(200μg)，第2～28天给予大鼠每天2次香烟烟熏,每次烟熏香烟12支，持续时间大约1h，间隔4h(滴脂多糖当天不烟熏)。被动吸烟方法：将大鼠放入自制的有机玻璃染毒箱(100cm×80cm×50cm)内，将香烟放入自制烟熏装置中，点燃后，用打气筒将香烟烟雾注入染毒箱内(此操作频率为1支烟/5min)，进行大鼠被动吸烟染毒。为减少香烟燃烧所产生的水蒸气对大鼠的影响，采用冷凝管降低香烟温度、湿度，并在箱底放置适量硅胶干燥剂。第28天气管再次滴LPS制作COPD急性加重模型。从第16天每3天经尾静脉缓慢注射0.6%FeCl3(0.2mL/100g大鼠)制作COPD合并肺心病模型。

1.4 动物处理及指标检测

1.4.1 一般情况观察 包括大鼠的活动度、对外界反应的灵敏度、皮毛光泽、口唇鼻毛色泽、体质量、饮食、呼吸等情况。

1.4.2 取材及指标检测 大鼠用水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉，用经肝素钠冲管的5mL注射器经腹主动脉抽取5mL新鲜血液后，放血处死。迅速剪开胸腔取出心肺组织，用冰水冲洗血迹，用滤纸吸去水分，一部分放入装有福尔马林的病理瓶，经10%中性福尔马林48h充分固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续4μm切片2张，分别进行常规HE染色。另一部分放入石蜡盘中，垂直心肌纤维方向，切成1mm×1mm×2mm大小，放入-70 ℃，备电镜观察。血液经1 200r/min低温4 ℃离心15min后取血浆，-70 ℃保存，RT-PCR法检测抗M2受体抗体mRNA的表达。方法如下：2 500r离心20min，取血浆上清液1mL，采用LiquidSampleRNAReagent、氯仿/异丙醇法提取组织中RNA，按逆转录试剂盒说明操作，逆转录成cDNA后进行PCR扩增。PCR反应条件为95 ℃预变性10min，95 ℃变性15s，60 ℃退火1min，40个循环。抗M2受体抗体mRNA碱基序列：上游：5＇-CgCTCCTTgATgCTACTg-3＇，下游：5＇-TTgCTgCCCTTgTTgTAC-3＇。

2 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠一般情况观察 正常组大鼠活动度可，对外界反应灵敏，皮毛光亮，口唇鼻无紫绀，体质量较其他组大鼠重，饮食呼吸可。COPD组大鼠活动度尚可，对外界反应灵敏，皮毛黄暗，无光泽，可闻及呼吸音、哮鸣音，活动无明显受限。COPD急性加重期大鼠活动受限，对外界反应灵敏，皮毛黄暗，无光泽，可闻及呼吸音、哮鸣音，口唇紫绀，本组死亡率最高。COPD合并肺心病组大鼠活动受限，活动后心跳明显加快，呼吸急促，口唇紫绀，哮鸣音明显。

3.2 血抗M2受体抗体mRNA表达 见图1。

注：△▲与正常组对照，□■与CODP组对照：△□P<0.05，▲■P<0.01。图1 各组大鼠血浆抗M受体抗体mRNA含量

抗M2受体抗体mRNA在B组，C组，D组的表达依次增高C,D组较A组有明显增高(P<0.01)。D组表达最高，较AB均有明显增高(P<0.01)。

3.3 电镜下心脏超微结构 见图2。

正常对照组A：心肌细胞正常，线粒体丰富。COPD组B：心肌内血管上皮部分损伤。COPD急性加重组C：核膜受损，线粒体肿胀，纤维排列不规则。COPD并发肺心病组D：核膜不完整，线粒体肿胀，纤维排列不规则，模糊。

4 讨论

目前发现多种心脏病患者血清中存在抗心脏M2胆碱能受体的自身抗体。Magnusson等[2]在研究原发性扩张性心肌病中发现患者血清中存在抗心脏β1肾上腺素能受体的自身抗体，之后又有研究发现， 在该病患者血清中存在抗心脏M2胆碱能受体的自身抗体。国外研究小组的研究还证明[3]，利用β1或M2受体表位肽段长期免疫动物，可造成心脏发生类似IDCM的形态学改变，类似肺心病的病理改变。这些提示在肺心病出现右心衰竭的发病过程中，可能也有心脏受体抗体的免疫学机制参与，心肌内多种抗体:心肌线粒体ADP/ATP载体抗体、抗肌球蛋白抗体、抗β1受体抗体、抗心脏M2胆碱能受体抗体，尤其可能是M2受体自身抗体的参与。另一方面，近年来的研究表明，在慢性阻塞性肺疾病发病过程中，心脏主要受体的功能有明显的变化，并发现循环血中免疫复合物增加与心功能异常有相关性。本实验发现在COPD模型组也出现抗M2受体抗体的表达增高，并且浓度与心肌损害程度有一定相关性，同时与光镜电镜下观察到COPD不同时期的心肌损害程度有一定相关性，提示在COPD疾病状态下已经开始出现心脏病变，心肌损害因素已经产生，这对于COPD时期预防肺心病形成具有重要意义。同时本实验也表明，COPD时期已经出现自身免疫系统的紊乱，也可能伴随有除抗M2受体抗体外的多种自身抗体的产生异常，从一定程度上阐述COPD的发病伴随有自身免疫功能的异常，可能为COPD的发病因素提供新的方向以及为COPD的治疗和肺心病的预防提供新的途径。

图2 电镜下心脏组织超微结构

中医学认为，COPD主要病机乃“虚、痰、瘀”，病理变化为本虚标实、虚实夹杂的证候，气虚血瘀的病理变化贯穿整个病程。急性加重期以实为主，稳定期以虚为主，病位在肺，与心、肝、脾、肾诸脏密切相关[4]。本病多属渐积而成，秉承缠绵，经常反复发作，难期根治。若患者久病体衰，导致心气不足，心脉上通与肺，气血鼓动无力，就会出现血脉瘀滞。反过来瘀血会导致气机升降失常，进一步加重病情[5]。同时肺胀是以肺气胀满不能收敛为主要特征，气机升降是其重要病机[6]。心肺在生理上密切相关，功能上相互作用，病理上相互影响。心肺两脏调节气血运行的作用密切相关，气血运行失常是肺胀发生的重要原因。

肺心病起病首先以肺为重，即首先出现的症状和特点以肺系为主，最终形成肺心病并累及至心系。中医认为：COPD属于肺心同病，以肺、心为中心兼及五脏。虽然肺心病的最终发展结果一定是五脏功能失调，但是五脏受损的轻重程度不同，不同脏腑在肺心病的发病中所起的作用不同，心肺是主要病位，是发病核心。本实验进一步认证了五脏一体观的科学性。把“见肺之病，知肺传心，当先调心”作为治疗COPD，预防肺心病发生的重要指导思想。

[1]Gershwin,M.E.riskfactorsandcomorbiditiesinprimarybiliarycirrhosis:Acontrolledinterview-basedstudyof1032patients[J].Hepatology,2005,42(5):1194-1202.

[2]宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及药物干预的影响[J].军医进修学院学报，2001，22(2)：99-102.

[3]JohnWA,JoanHB.G-proteiningrowthandapoptosis:lessonsfromtheheart[J].Oncogene,2011(20):1626-1634.

[4]林琳,吴蕾,许银姬.慢性阻塞性肺疾病五脏相关理论之病机传变模式探讨[J].江苏中医药，2008，40(8)：67-69.

[5]考希良，张伟.从瘀探讨肺纤维化的中医病因病机[J].吉林中医药,2012(10)：1250-1251.

[6]张伟，孙璐璐.肺间质与筋的关系及慢性阻塞性肺疾病治疗新思路[J].吉林中医药,2012(6)：550-551.

R541.5

A

1003-5699(2013)06-0609-03

“泰山学者”建设工程专项经费资助(ts20110819)及山东省自然科学基金项目(Y2006C114)。

张 伟(1963-)，男，主任医师,教授，博士，博士研究生导师。研究方向：中医肺病学。

*[通信作者] 姚玉强，Tel:18766400195，E-mail：254586177@qq.com。

2012-11-26)