基因工程菌去除镉离子的数学模型研究

2013-10-26马青兰曹秋芬孟玉平

太原理工大学学报 2013年1期

马青兰，王楷，张弛，曹秋芬，孟玉平

（1.太原理工大学环境科学与工程学院，太原 030024；2.山西省农业科学院农业生物技术研究中心，太原 030031）

土地和水是地球上重要的自然资源，然而在过去的几十年里却被各种复杂的有毒化合物污染，其中就包含重金属[1]。2005年，广东北江韶关段镉严重超标事件，2006年的湘江湖南株洲段镉污染事故，2009年的湖南省浏阳市镉污染事件，2012年广西龙江河的镉污染等，严重地威胁着人民的健康。重金属镉具有毒性，长期接触会引起慢性中毒，影响人体肾功能。常规的重金属处理方法受经济技术指标的限制有着局限性。利用基因工程构建高选择性基因工程菌，可以提高枣金属硫蛋白（ZjMT）[2]与金属离子的亲和能力，增强微生物接受金属离子的能力，对枣金属硫蛋白的去除过程进行数学模拟不仅具有较高的研究价值，还能减少不必要的工作量，既节省实验时间，又节约原料。华中农业大学路延笃做过猴金属硫蛋白对重金属的吸附试验[3]；厦门大学邓旭等人运用基因工程技术处理重金属废水[4-5]；本研究项目成功提取了枣金属硫蛋白，并把它导入大肠杆菌成功繁殖，用工程菌处理重金属。该项目取得了国家专利，获得了枣树金属硫蛋白基因的cDNA 序列，在国际基因库 DDBJ／EMBL／GenBank中的注册序号是AB513130。本模型将实验数据进行了整理，对米-门方程进行了改进，用MATLAB5.3拟合出数学模型，又通过实验对方程进行了验证。该方法提高了实验效率，降低了成本。

1 实验材料仪器和方法

1.1 菌株

试验中所用的菌株均由山西省农科院生物研究所提供。宿主菌为E.coli BL21（DE3），导入载体pGEX-4T-2的对照菌pGEX-B和导入重组质粒pGEX-4T-2-ZjMT的基因工程菌pGEX-ZjMT-B。其中，基因工程菌pGEX-ZjMT-B是以从枣树的cDNA文库中获得的基因SpotⅠ-MT为模板，用PCR方法扩增出MT基因225bp特异片段，将其亚克隆入pBluesciptIⅡSK-T载体，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别酶切重组pBluesciptⅡSKT质粒和原核表达载体PET28a，然后将MT基因片段和表达载体PET28a通过T4DNA连接酶进行定向连接，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切和PCR方法双重鉴定重组表达质粒。

1.2 基因工程菌pGEX-ZjMT-B处理重金属镉的作用机理

1）直接机理。基因工程菌pGEX-ZjMT-B应用紫外光谱、圆二色谱等方法研究确定其有许多孤对电子，可以和重金属离子诸多空轨道形成稳定的配合物和螯合物。

2）间接机理。金属离子在细胞表面的吸附，即细胞外多聚物和胞壁上的官能团与金属离子结合的被动吸附。去除机理中吸附作用是在5min左右完成，螯合作用在整个去除过程起关键作用，发生在0～48h之间。前两个小时生长进入对数期，20～24 h之间，pGEX-ZjMT-B基本进入稳定期，往后进入衰减期。

1.3 主要仪器

本实验采用的主要仪器有SHY-2A型水浴恒温振荡器，722E型可见分光光度计，LRH-250-Ⅱ培养箱，101型电热鼓风干燥箱，SW-CJ-1D无菌操作台，高压锅等。

1.4 实验方法与步骤

1）先准备30个型号相同的培养皿，用稀硝酸浸泡12h后用去离子水清洗，在无菌室晾干；称取NaCl 2.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1g，放入200 mL蒸馏水中充分搅拌溶解，密封好在121℃高压锅中灭菌，使用时加热到40℃。把培养皿分三组，每组10个；把原菌液用去离子水依不同比例稀释，稀释后按稀释顺序给第一组培养皿分别加入1mL的菌液，再做两个平行样。把40℃的培养基加入到培养皿，待凝固后倒置于4℃的培养箱，24h后取出，按网格法数出菌落数，计算平均值求得ln nCF。以培养基为对照，分别测出不同时间下600nm的吸光度值（DO600）。

2）取500μL已活化培养的菌液加入到50mL LB新鲜培养基中，记录移入菌体的时间，并测量初始的DO600值，37℃振荡培养。每隔一定的时间测量DO600，当DO600为-0.06左右时，加入 Cd2＋，观察不同浓度下，细菌生长曲线的变化。记录取样时间，每隔两小时依次取样测定DO600的值。

2 基因工程菌pGEX-ZjMT-B增长率和Cd2＋浓度的数学模型

基于米-门方程，建立了基因工程菌pGEXZjMT-B增长率和Cd2＋浓度的数学模型。为研究重金属Cd2＋对基因工程菌pGEX-ZjMT-B增长率的影响，首先要建立镉离子浓度对菌生长情况影响的关系式。模型中所用的数据以最小二乘法求得。笔者认为，去除重金属是一个快速的反应过程，可忽略菌的内原代谢。对其结果研究发现，这样做既方便数学模型的建立，又符合实际工程运用。

3 数学模型建立过程

3.1 数学模型建立

不同Cd2＋含量溶液中基因工程菌pGEXZjMT-B的平均生长速率的变化值见表1所示。

表1 pGEX-ZjMT-B的平均生长速率

根据表1，拟合一次线性方程得：

DO600的平均变化值即基因工程菌pGEX-ZjMT-B的生长速率，用MATLAB5.3软件的优化工具中任意曲线拟合出DO600和lg nCF的函数方程为：

这个方程的建立可以方便地从DO600直接求出菌浓度的值，如图1所示。

图1 DO 600和菌浓度的关系

由式（2）式（3）可以得出，菌浓度lgnCF和 Cd2＋浓度的关系式，联合米-门方程最终得出我们想要的基因工程菌pGEX-ZjMT-B增长率和Cd2＋浓度的数学模型如下：

3.2 模型验证

比较方程结果和试验结果如表2所示。结果表明，方程和试验结果基本一致。

表2 方程结果和试验结果

4 结果与讨论

4.1 方程系数的求解

本模型的建立是在基因工程菌最佳生长条件下进行的，并假定它对镉的去除是一个快速的反应过程。在菌被激活后不断测定DO600值，直到DO600＝-0.06，此时它的生长进入对数期，细胞生长不受限制，而且

4.2 两种测量菌浓度方法的差异

传统上是把DO600直接看做菌浓度，而这种方法有太多不便和不合理。例如，在使用分光光度计时对照液的选取，有时用蒸馏水，有时用原液；本实验用的是原培养基，这就造成DO600测量值明显不同，如图2所示。图中，菌种的质量浓度分别为0，300，600，900，1200μg／L.从图中可以看到一种变化趋势，并能表示不同镉离子浓度下DO600的变化。图3是lgnCF随时间变化的曲线。

图2 不同浓度Cd2＋对菌生长情况的影响

图3 菌随时间的变化

用DO600表示菌浓度简单方便，能表示工程菌生长的基本趋势。虽然用拟合的方程直接求菌浓度，方法很麻烦，而且每种菌的曲线有差异，但是它能直接得出菌浓度，计算中需要用菌浓度时就方便了，并且从方程中可以求得任意时间的菌浓度，不需要每次都测量，省时省力。虽然f（x）有增减区间，但是f（x）是恒大于零的。因此，基因工程菌pGEX-ZjMT-B的增长速率是减小的，这与图（2）显示相吻合。而图3更清晰地展示了工程菌生长的曲线，经过多次线性拟合发现六次方程吻合性更高，但为了计算方便可换成低次计算。