皮肤疣自体植入疗效与HPV型别的关系

何泳洁，曹碧兰，汪治国，陈晓红，曾 霓，颜廷凯，孙文倩，陶 锐

(1.遵义医学院附属医院 皮肤科，贵州 遵义 563099；2.成都市第五人民医院 皮肤科，四川 成都 611130；3.咸宁市中心医院同济咸宁医院市皮肤科，湖北 咸宁 437100)

皮肤疣自体植入疗效与HPV型别的关系

何泳洁1，2，曹碧兰1，汪治国3，陈晓红1，曾 霓1，颜廷凯1，孙文倩1，陶 锐1

(1.遵义医学院附属医院 皮肤科，贵州 遵义 563099；2.成都市第五人民医院 皮肤科，四川 成都 611130；3.咸宁市中心医院同济咸宁医院市皮肤科，湖北 咸宁 437100)

目的通过TSP-PCR技术，检测本地区皮肤疣患者(寻常疣、跖疣和扁平疣)感染HPV的型别，探讨皮肤疣自体植入疗效与HPV型别的关系。方法收集皮肤疣患者149例，通过皮肤疣自体植入治疗，同时取其疣体组织进行HPV基因型别检测。结果完成随访102例患者中HPV检出率高达99.02%(101/102)，所设计的型别均有检出。其中多种HPV型别检出率较单一型别多，为58.42%。皮肤疣自体植入疗效表明，寻常疣、跖疣和扁平疣治疗有效率无统计学差异(χ2=0.225，P>0.05)。HPV单一和多种型别感染的治疗有效率差别无统计学意义(χ2=1.422，P>0.05)。<18岁组的治疗有效率明显高于>35岁组；病程<1年组有效率明显高于病程>3年组。结论皮肤疣自体植入治疗对单一及多种HPV型别感染均有效，对<18岁病程<3年的患者疗效较好，对>35岁病程>3年的患者疗效较差，这对于临床早期治疗具有现实指导价值。

皮肤疣；自体植入；人乳头瘤病毒；HPV型别；PCR

皮肤疣是由人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染所致的常见皮肤病，按其临床表现和发病部位不同分为寻常疣、跖疣、扁平疣等[1]，不同类型皮肤疣所感染的HPV型别也有所差异，其中HPV1、2、3、4、7、10、27、28、40、41、57、63和65型为皮肤疣感染的常见型别[1-3]。皮肤疣自体植入疗法是一种人工主动免疫方法，对治疗皮肤疣效果较好，目前国内外报道显示其治愈率在70%～97%[4-7]。本实验通过型特异性引物PCR(type specific primer, TSP-PCR)技术，检测寻常疣、跖疣和扁平疣患者感染HPV的最常见型别，包括HPV1、2、3、4、7和10型，探讨皮肤疣自体植入疗效与HPV不同型别的关系，为临床疗效提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入研究的病例为2007年7月至2011年4月在遵义医学院附属医院皮肤科门诊就诊的皮肤疣患者149例，失访47例，完成随访102例。在完成随访的病例中，寻常疣31例、跖疣29例、扁平疣42例；男52例，女50例；5～62岁，平均25.21±11.88岁；病程1个月～30年，平均3.94±5.31年；<18岁的27例，18～35岁的54例，>35岁的21例；病程<1年的38例，1～3年的29例，>3年的35例。每位患者疣体数8～200个。入选患者3个月内未接受干扰素、胸腺肽及IL-2等抗病毒及免疫调节剂治疗，伴有自身免疫性疾病及严重的系统性疾病者除外。扁平疣样本取材于面部和手背，少部分为颈部和前臂；寻常疣样本取材于手背、手指和足缘；跖疣样本取材于足底。

1.2 样本采集 选择患者新生疣体，常规消毒后用2%利多卡因局部浸润麻醉，削去表皮角质层，切取米粒大小疣体两份，一份用于植入治疗，另一份置于装有生理盐水的1.5 mL离心管中，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.3 皮肤疣自体植入治疗方法 将切取的其中一份米粒大小疣体组织剪成M型(增大疣体与机体接触面积)，用生理盐水冲洗后置入75%乙醇中浸泡20 min，放入生理盐水中备用，在上臂三角肌或前臂屈侧部位，常规消毒及局麻后切开皮肤达脂肪层，长0.5～1.0 cm，眼科无齿镊沿切口一侧做钝性分离，使皮下形成一个小间隙，将备用M型疣体植入皮下，用0号丝线缝合切口，1周后拆线。第1～3月每2周随访1次，第3～6月每月随访1次，观察疗效；之后每半年随访1次，了解复发情况。

1.4 疗效判定标准 疣体全部消退判定为痊愈；疣体较前变平、消退70%以上判定为显效，痊愈和显效均判定为有效；术后6个月，疣体消退仍不足70%或未见消退判定为无效。

1.5 HPV分型方法(见表1)

1.5.1 标本DNA提取 按照AxyPrep基因组DNA小量试剂盒说明书提取DNA，抽提的DNA置于-20 ℃保存，用于TSP-PCR扩增。

1.5.2 TSP的设计 所用HPV1、2、3、4、7和10型的TSP，均由上海生工公司按表1方案设计合成。

1.5.3 TSP-PCR反应酶系统为美国Promega公司的GoTaq@Master Mixes，采用50 μL体系，按说明书加Taq Mix25 μL，引物各1 μL(10 μM)，DNA模板2 μL，加去离子水补足50 μL。PCR仪为美国Bio-Rad公司C1000TMThermal Cycler梯度PCR扩增仪。最佳反应条件为95℃，预变性5 min，35个循环(95 ℃，30 s，50～60 ℃，30 s，72 ℃，30 s)，72 ℃延伸5 min。

1.5.4 PCR产物的半定量分析 ①琼脂糖凝胶电泳:配置2%琼脂糖凝胶，扩增产物分别取5 μL于80V、50mA条件下进行电泳45 min；②产物分析:在凝胶分析系统上进行摄像，分别对得到的扩增产物条带长度进行分析，判断是否为HPV型别的目的条带。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，计数资料采用χ2检验。按α=0.05检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。多组间有差异时所选用的两两比较方法。

表1 HPV分型设计使用的特异性引物[8-9]

HPV型别引物序列产物长度/bp退火温度/℃HPV15-AATARGTTWGATGATGCWGAA-35-AKRTARTCWGGATATTTGCA-3309～32850HPV25-GGGGATATGGTTGAAACAGGT-35-CAGAGGACACCATAGAGCCA-329457HPV35-AACTCTAAYATWGCACATG-35-CAVGTRCSYTGGCAAATATC-327355HPV45-GGAGATACAGAAAATCCT-35-SHATCTCCATAGATATCTTT-3330～33550HPV75-GTGTGATACTCCCTTGCACTC-35-GGAACTTTGACCTAGCAATTTG-341755HPV105-ATGTCCATGGGTGCACAGGAA-35-CTGTGGGATGCGGACCGTGCA-344460

注：表中H=A、T或C；K=G或T；R=A或G；S=C或G；W=A或T；Y=T或C。

2 结果

2.1 TSP-PCR结果 ①在102例皮肤疣样本中，TSP-PCR阳性101例(见表2)，HPV感染检出率99.02%;②设计的6种HPV型别均有检出(见表2、图1)。寻常疣、跖疣以HPV2、1和4型感染为主，扁平疣以HPV2、10、3和1型为主；③阳性标本中，有42例(41.58%)为单一HPV型别感染；有59例(58.42%)同时存在2～4种HPV型别感染(见表3与图2～4)，其中二重感染34例(33.67%)，三重感染21例(20.79%)，四重感染4例(3.96%)；多种HPV型别感染的组合趋于多样化，以HPV1+2型最多(20例)，其次为HPV1+2+10型(8例)；④新发现寻常疣感染HPV3和10型，扁平疣感染HPV7型。

表2实验组样本HPV型别感染情况

病 种例数HPV1HPV2HPV3HPV4HPV7HPV10寻常疣3112251703跖 疣2921220200扁平疣421633211223总 计10249(48．04)80(78．43%)22(21．57%)10(9．80%)2(1．96%)26(25．49%)

表3单一和多种HPV型别感染情况

病 种HPV型别单一型别感染1(9)，2(23)，3(3)，4(3)，10(4)多种型别感染1+2(20)，2+10(5)，2+3(4)，1+3(1)，2+4(3)，1+10(1)，1+2+10(8)2+3+10(4)，1+2+3(4)，1+2+4(3)，2+3+7(2)，1+2+3+10(3)，2+3+4+10(1)

图1 HPV1、2、3、4、7和10型的TSP-PCR阳性结果

图2 1例寻常疣同时感染HPV1和2型的TSP-PCR阳性结果

图3 1例扁平疣同时感染HPV2、3和7型的TSP-PCR阳性结果

2.2 皮肤疣自体植入治疗结果

2.2.1 寻常疣组、跖疣组和扁平疣组3组患者，经皮肤疣自体植入治疗其有效率分别为70.97%(22/31)、75.86%(22/29)和71.43%(30/42)(见表4)。3组之间疗效差异均无统计学意义(χ2=0.225，P>0.05)。

表4皮肤疣自体疣植入疗效比较

病 种例数有效无效有效率/%寻常疣3122970．97跖疣2922775．86扁平疣42301271．43合计102592872．55

2.2.2 单一和多种型别HPV感染疗效比较 单一型别HPV感染治疗的有效率为78.57%(33/42)，而多种型别感染的有效率为67.80%(40/59)，两组差异无统计学意义(χ2=1.422，P>0.05)。

2.2.3 不同性别疗效比较 男性患者有效率为69.23%(36/52)，女性患者有效率为76.00%(38/50)，两组差异无统计学意义(χ2=0.586，P>0.05)

2.2.4 不同年龄段疗效比较 <18岁组、18～35岁组与>35岁组有效率比较有统计学意义(χ2=9.864，P<0.05)。其中年龄<18岁组有效率为92.59%(25/27)，明显高于18～35岁组70.37%(38/54)和>35岁组的有效率52.38%(11/21)，差异均有统计学意义(χ2=5.143、10.187，P均<0.05)，但18岁～35岁组与>35岁组的有效率差异不显著(χ2=2.142，P>0.05)。

2.2.5 不同病程疗效比较 病程<1年组、1～3年组与>3年组3组间有效率比较有统计学意义(χ2=13.346，P<0.05)。病程<1年组的有效率为92.11%(35/38)，明显高于1～3年的有效率68.97%(20/29)及>3年组的有效率54.29%(19/35)，差异有统计学意义(χ2=5.990，P<0.05)，但病程1～3年组有效率与>3年组的有效率差异无统计学意义(χ2=1.785，P>0.05)。

2.3 不良反应和复发情况 寻常疣和跖疣患者疣体脱落过程表现为脱屑、疣体逐渐萎缩、变平至脱落，个别患者疣体脱落前可出现瘙痒、疼痛。扁平疣患者疣体脱落前多有局部发红、瘙痒或疣体增多、增大现象，随后1～2周内疣体逐渐脱落。3组患者疣体切取和植入部位均无明显瘢痕和感染等不良反应。对74例治疗有效的患者随访1～3年，仅1例跖疣患者术后5个月时复发，有15例随访3年以上，均未见复发。

3 讨论

以往关于HPV型别的研究大多集中在粘膜或生殖器疣，随着分子生物学的发展特别是PCR的应用，与皮肤疣相关的HPV型别逐渐被揭示，且皮肤疣HPV型别与生殖器疣存在较大差异。本实验采用TSP-PCR扩增，HPV检出率高达99.02%，单一型别HPV检出率为41.58%，多种型别HPV检出率为58.42%。所设计的目标类型HPV1、2、3、4、7和10型，在寻常疣、跖疣和扁平疣中均各自分别有不同程度的检出。寻常疣、跖疣感染型别主要为HPV2、1和4型，扁平疣感染型别主要为HPV2、10、3和1型，其中HPV2型感染率最高。另外，相对单一型别HPV的检出率，多种型别检出率更高，且组合方式呈现出多样化的趋势。HPV的多重感染以往文献中也有报道，特别是在尖锐湿疣和宫颈癌中报道相对较多。李娟、宋守荣等[10]检测贵阳地区60例尖锐湿疣HPV型别，结果HPV混合感染率为80%，以HPV6+11或两者与HPV16、18混合感染为主，并认为混合感染率较高可能与地区、人群差异有关。彭方毅等[11]报道在喉癌中也存在HPV感染，利用6对TSP联合基因测序发现，大多特异型别均与HPV16型同时存在于同一病例中。也有学者发现，宫颈癌中HPV16、18和33型常有二重感染，特别是HPV16为二重感染中最常见的型别，认为HPV多重感染与HPV某些特异型别有关[12]。本实验结果显示，HPV2型可能为遵义地区皮肤疣感染的优势基因种族，这可为今后有针对性地研制和应用抗皮肤疣HPV疫苗提供有意义的参考。同时，皮肤疣多重感染率高在一定程度上提示在疫苗的研发时需考虑同时抵抗多种型别的HPV感染。

临床上应用皮肤疣自体植入疗法已有20余年，以往研究表明机体感染HPV后病毒样颗粒仅见于颗粒层和角质层，HPV抗原与免疫细胞接触机会少，感染局部的抗原信号弱，因此增加HPV抗原与机体免疫细胞接触机会对于打破HPV感染的免疫耐受非常重要。该疗法利用自身疣体组织经严格消毒处理后植入自身皮下，作为一种抗原进入机体后使T细胞致敏，致敏的T细胞识别抗原递呈细胞递呈的MHC-抗原复合物(第一活化信号)，并在协同刺激信号(第二活化信号)作用下，T细胞活化、增殖、分化成针对这一特定抗原的致敏淋巴细胞，进而使疣体组织受到排斥而脱落。国内外学者应用此疗法治疗皮肤疣均取得了较好疗效[4-7]，本研究结果对扁平疣、跖疣、寻常疣总有效率为72.55%。

从HPV感染型别的角度分析该方法治疗皮肤疣的疗效情况，由于单一型别的感染主要集中在HPV2型，某些单一型别感染例数较少，因此无法对各单一型别间的疗效进行比较。而多种型别HPV感染呈现多样化，每种组合方式例数也均较少，故也未对多种型别HPV感染与疗效之间比较，本文仅分析单一型别与多种型别HPV感染的疗效，结果显示两者间无明显差异，表明该疗法不仅对某种特定的HPV型别感染有效，而且对不同型别HPV感染均有效。原因可能与实验样本容量不够大因而掩盖了它们之间的差异性有关；从另一方面看，这或许暗示着各种皮肤疣HPV型别之间由于同源性可能本质上存在非常类似或者相同的自身免疫应答机制，值得深入探讨。从患者年龄及病程情况分析，<18岁组的治疗有效率明显好于18～35岁组和>35岁组，病程<1年组的明显高于1～3年及>3年组。这可能与机体在不同的年龄段，对抗原刺激所产生的敏感性及耐受性不同，自体免疫反应程度的强弱亦有所不同有关；而病程>3年组疗效相对较差，是否与机体的免疫耐受或病毒毒力减弱未刺激机体产生免疫反应有关，有待于进一步研究。皮肤疣自体植入疗效与患者年龄和病程之间明显的依赖关系，对于皮肤疣患者的临床早期治疗具有现实指导价值。

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[收稿2013-02-12;修回2013-04-18]

(编辑：谭秀荣)

TherelationshipsbetweenthecurativeeffectsofAuto-verrucaimplantationandHPVgenotype

Heyongjie1，2,Caobilan1,Wangzhiguo3,Chengxiaohong1,Zengni1,Yantingkai1,Sunwenqian1,Taorui1

(1.Department of Dermatology，The Affiliate Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099，China；2.Department of Dermatology Fifth People’s Hospital of Chengdu，Sichuan Chengdu 611130，China；3.Department of Dermatology，Central Hospital of Xianning，Hubei Xianning 437100，China)

ObjectiveTo detect the HPV genotype of local patients with skin warts, including verruca vulgaris, plantar warts and flat warts, by using the type specificity primer PCR method, and to discuss the relationship between the curative effects of auto-verruca implantation and the HPV genotype.MethodsCollect 149 patients with skin warts from the dermatological department outpatient of Zunyi Medical College affiliated hospital. Take the warts tissue for auto-verruca implantation treatment. Meanwhile, extracting genomic DNA samples from the skin warts, define and analysis the HPV gene sequences and genotype, and discuss the relationship between the curative effects of auto-verruca implantation and the HPV genotype .ResultsComplete the follow-up of 102 patients, it is found that the total detection rate of HPV is 99.02% .And all the type designed was detected out. The most type that detected was multi-infections and the infection rate is 58.42%. The effective rates of auto-verruca implantation to treat verruca vulgaris, plantar warts and flat warts have no statistical significances of the differences(2=0.225，P>0.05). The effective rate between mono-infection and multi-infections have no statistical significances of the differences(2=1.422，P>0.05). The effective rate of patients no more than 18 years old which is obviously higher than that of the patients more than 35 years; the effective rate of patients whose course of disease is more than 3 years which is obviously lower than that of the patients whose course of disease is less than 1 year.ConclusionAuto-verruca implantation is effective not only for the mono-infection of HPV type of skin warts, but also for the HPV multi-infections. The curative effect of auto-verruca implantation is better for the patients whose age is under 18 and whose course of disease is less than 3 years. However, the curative effect was worse of the patients whose age is above 35 and whose course of disease is more than 3 years.It has realistic significance of early treatment for skin warts patients.

skin warts; autoimplantation; human papillomavirus; HPV genetype; PCR

R 76

A

1000-2715(2013)03-0228-05

遵义市科技局资助项目(NO：遵市科合社字200810)。

曹碧兰，女，主任医师,硕士生导师，研究方向：皮肤免疫学，E-mail:caobilan@163.com。