降解2，6-二叔丁基苯酚菌种的驯化与鉴定

2013-10-25马海娟

微生物学杂志 2013年5期

马海娟

(开朗(上海)生态科技有限公司，上海 201203)

含酚有机物被广泛地用于木材防腐剂、防锈剂、杀菌剂和杀虫剂等，是化工、钢铁等工业废水的主要有毒成分。其对许多微生物具有抑制毒害作用，在环境中难以被微生物分解。国内外有许多对这类物质生物降解研究的报告［1-3］，但对2，6-二叔丁基苯酚(2，6-DTBP)生物降解报道很少［4］。2，6-二叔丁基苯酚是受阻酚类抗氧化剂的主要母体，广泛用于橡胶、化纤等行业，同时又是合成医药中间体的重要原料，也可直接用作润滑油抗氧剂。该物质对水中的鱼类、藻类和微生物有很大的毒害作用［5］，且难于生物降解［6］。本研究以2，6-二叔丁基苯酚为唯一碳源，通过菌种采集、平板分离纯化，初步筛选出对2，6-二叔丁基苯酚有降解作用的菌株。对筛选出的多株菌种进行对底物降解作用的考察，从中选出实验所用菌种，对其驯化，并进行了形态学、生理生化以及分子生物学的鉴定，以期为高效降解工业废水提供优良的微生物菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株采自上海某石化腈纶厂废水处理站的塔式生物滤池和沉淀池水，经分离和筛选得到1株能降解2，6-二叔丁基苯酚的M-Z-8菌株。

1.1.2 试验底物 2，6-二叔丁基苯酚(2，6-DT-BP)，分析纯，由北京助剂研究所提供。

1.1.3 萃取剂正己烷，分析纯(≥97.0%)，由中国医药(集团)上海化学试剂公司提供。

1.1.4 培养基肉汤培养基［7］:牛肉膏5 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 L，pH 7.2(固体培养基另加琼脂16 g);Bushnell-Hass(B.H.)基础培养基［8］:MgSO40.2 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO41 g，CaCl20.02 g，K2HPO41 g，FeCl3(60%)2 滴浓缩液，蒸馏水 1 L，pH 7.0。

1.1.5 菌悬液将32℃下生长24 h的斜面菌种接种到装有30 mL肉汤培养基的250 mL三角烧瓶中，在37℃、250 r/min的恒温摇床中培养24 h。然后将种子液经过3次离心(8000 r/min，每次10 min，4 ℃)、2次水洗(用0.85%无菌生理盐水)，最后用同样的生理盐水稀释成一定浓度(以单位体积的细胞湿重(w/v)表示)的菌悬液。

1.2 方法

1.2.1 驯化及其效果考察 ①菌种驯化:将3 mL浓度为3%的M-Z-8菌株菌悬液接种到含30 mL的B.H.基础培养基的三角烧瓶中，加入浓度为500 mg/L的2，6-二叔丁基苯酚作为唯一碳源和能源。在37℃、250 r/min的摇床中培养，待培养基溶液明显浑浊后，再取上述驯化液3 mL接种到含浓度为500 mg/L的2，6-二叔丁基苯酚的30 mL新鲜B.H.基础培养基中继续驯化。重复多次，最后取上述驯化液进行效果实验;②驯化效果考察方法:分别取未经驯化的斜面菌种和4次驯化后的菌液接种到肉汤培养基上增殖，30℃恒温培养20 h后，制备成3%的菌悬液。再接种1 mL菌悬液到底物浓度为100 mg/L的30 mL B.H.基础培养基(pH=7.0)中(相当于接种量为0.1%)。将未接种和接种的三角瓶置于37℃、250 r/min摇床培养，相隔一定时间取样，测定2，6-二叔丁基苯酚的浓度变化。

1.2.2 样品分析 ①检测条件的确定:采用UV-2201型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)分析2，6-二叔丁基苯酚的浓度变化。通过对不同浓度的样品扫描，发现276 nm为2，6-二叔丁基苯酚的紫外特征吸收波长，故选择在λ=276 nm时测定样品;②样品预处理及分析:在含30 mL样品溶液的各摇瓶(包括空白对照样品瓶)中加入10 mL正己烷，振荡2 min后迅速倒入离心管，4℃、8000 r/min条件下在Sorvall SuperT21离心机上离心8 min，抽取上清液2 mL，于10 mL容量瓶中定容至刻度，276 nm处用紫外-可见分光光度计测定2，6-二叔丁基苯酚的浓度。

1.2.3 菌种的鉴定主要参照伯杰氏手册［9-10］和其他相关的文献［11-12］，通过形态和生理生化等特征研究，对本研究所使用的菌种进行鉴定。①菌落特征:在肉汤培养基琼脂平板上划线接种，30℃培养3 d，观察菌落特征;②菌体形态:菌体涂片后，采用结晶紫简单染色法进行染色，然后在光学显微镜下(放大1500倍)观察菌体形态、大小。采用革兰染色法观察菌株的革兰染色结果。通过透射电镜观察鞭毛数量及着生位置等特征。

1.2.4 菌种的16S rDNA序列分析 ①细菌总DNA提取:用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀提取总DNA;②PCR引物:采用细菌16S rDNA通用引物F27(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和 R1492(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')通过PCR扩增供试菌的16S rDNA片段［13］;③PCR扩增、产物回收、连接转化以及测序:用引物对模板做PCR扩增反应，PCR的反应体系:10 × PCR Buffer 5 μL，MgCl25 μL，dNTP 1 μL，F27引物 2 μL，R1492 引物 2 μL，Template 0.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 39 μL。反应为35个循环，95℃保温10 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min;35个循环后再72℃延伸10 min。凝胶回收试剂盒回收凝胶上的PCR产物，用pMD18-T载体(大连宝生物公司)进行连接，转化大肠埃希菌DH5α的感受态细胞，然后挑取单克隆至4 mL氨苄抗性的LB培养基中37℃、250 r/min培养过夜。在2%的琼脂糖胶上电泳后，将胶进行染色，紫外灯下观察，与克隆前PCR产物的大小一致，确定为阳性克隆。将确定为阳性克隆的菌体进行测序;④同源性比较:将测序结果用BLAST软件与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 菌种的驯化效果

菌种驯化的方式各种各样，由于菌种对污染物具有一个适应的过程，可通过逐渐提高污染物底物浓度的方式，也可直接在高浓度下或通过诱变等方式对菌种进行驯化培养。本实验采用高浓度情况下对菌种进行驯化，来获得高活性的2，6-二叔丁基苯酚降解菌种。

图1所示的结果表明，未经驯化的M-Z-8菌株在12 d的时间里对2，6-二叔丁基苯酚的去除率为40.1%，而经过4次驯化后的菌种在相同条件下对底物的平均去除率达到了51.6%，与未驯化菌种相比，经驯化后的菌种对100.0 mg/L浓度的底物降解率提高了12%。

图1 驯化M-Z-8菌株对底物降解的影响Fig.1 The effect of acclimation on 2，6-DTBP degradation by M-Z-8

一般而言，当菌种进入到一个新环境时，对污染物存在着一段时间的适应期［14］。在此适应期内，微生物要通过诱导酶的合成，而且需要合成必需的辅酶或中间代谢物，来达到对污染物的适应，这期间对污染物的生物降解速率很小。一旦微生物被驯化，微生物便表现出很高的生物降解能力。在生物降解的后期，可能是由于降解产物的积累导致产生反馈抑制作用，也可能产生一些代谢产物改变了培养液理化性能，或产生一些有毒物质影响菌种生长，造成随后的降解速率趋于平缓。

2.2 鉴定结果

2.2.1 形态特征菌体形态:M-Z-8菌株为革兰阴性细菌，杆状，单个或2个存在，大小为(0.3～0.5)μm ×(1.0 ～3.0)μm，极生鞭毛(见图2)。

图2 M-Z-8菌株的透射电镜图(20000×)Fig.2 TEM of M-Z-8 strain(20000 × )

M-Z-8菌株菌落呈圆形，Φ1.0～2.0 mm，蜜黄色，不透明，表面光滑，湿润，低凸起，边缘整齐。

2.2.2 生理生化特征表1列出了菌株M-Z-8的生理生化特征试验结果。

表1 菌株M-Z-8的生理生化特征Table 1 Physiological＆biochemical characteristics of M-Z-8 strain

根据实验结果并结合文献资料，确认M-Z-8菌株符合气单胞菌属(Aeromonas)的特征，将M-Z-8菌株鉴定为气单胞菌(Aeromonas sp.)。

2.2.3 16S rDNA序列分析及其同源性比较以M-Z-8菌株的总DNA为模板，利用对细菌16S rDNA特异的引物F27和R1492进行PCR扩增，得到长约1.5 kb的PCR扩增产物，将获得的1.5 kb扩增产物进行DNA序列测定，结果见图3。

图3 M-Z-8菌株的16S rDNA核苷酸序列Fig.3 The sequence of 16S rDNA fragment of M-Z-8 strain

用BLAST程序对M-Z-8菌株的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果发现与多株气单胞菌种属的16S rDNA核苷酸序列同源性均在97%以上，其中包括Aeromonas hydrophila、Aeromonas molluscorum、Aeromonas encheleia、Aeromonas eucrenophila、Aeromonas salmonicida 和 Aeromonas popoffii，与生理鉴定结果吻合，对于其准确的分类地位需要结合其他的细菌学手段予以确定。

3 讨论

以2，6-二叔丁基苯酚为唯一碳源对初筛得到的菌种进行驯化，获得了1株对2，6-二叔丁基苯酚有较强降解能力的菌种。该菌株经过驯化后，对底物的生物降解能力比未驯化时有所提高，说明其对环境的适应能力有了提高。

通过对菌株进行的形态学以及生理生化鉴定，初步表明M-Z-8菌株为气单胞菌种属(Aeromonas sp.)。

对M-Z-8菌株的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，与气单胞菌种属的16S rDNA核苷酸序列同源性均在97%以上，包括Aeromonas hydrophila、Aeromonas molluscorum、Aeromonas encheleia、Aeromonas eucrenophila、Aeromonas salmonicida和Aeromonas popoffii。其与生理鉴定结果相吻合。

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