厌氧真菌菌系乙酰酯酶的特性研究

杨舒文，赵 蓓，迟 翔，李金阳，陈玉香，2*

(1.吉林大学生物与农业工程学院，吉林 长春 130022;2.吉林大学工程仿生教育部重点实验室，吉林 长春 130022)

秸秆是农作物经收获籽实、加工后的剩余物，其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素等有机质［1］，农作物光合作用生物产量的60%都存在于其中，因此蕴藏着丰富的能量。目前我国秸秆资源并没有得到合理有效的利用［2］，绝大部分被就地焚烧，造成了严重的能源浪费和环境污染。在能源危机的大背景下，生物质燃料的研发与生产日益受到重视，秸秆作为一种新型清洁的可再生能源［3］，具有潜在优势，探索高效降解秸杆的途径是有效利用秸杆类生物资源的前提。自然界中细菌、真菌、放线菌等微生物都可以分解利用秸秆类木质纤维素。研究表明，好氧细菌产生的纤维素酶组分较为单一，并且在自然界中含量较少;厌氧细菌所占比例较大但生长困难［4］。厌氧真菌可产生一个独特的多酶复合体系，在纤维素降解过程中具有较强优势［5］。因此现在研究的多为真菌，例如使用绿色木霉产生的纤维素酶进行纤维素的酶解糖化在美国已实现工业化生产［6］。目前国内外主要研究单一菌株产纤维素酶的能力［7］，在自然界中，木质纤维素是在各种微生物的协同作用下被降解利用的，因此在选择菌种时应充分考虑菌株之间的协同作用，发挥菌系的优势。另外，国内外对纤维素酶及木聚糖酶的研究都已经相对充分［8］，而对于降解半纤维素侧链中乙酰基的乙酰酯酶研究较少。由于木质纤维素通常高度乙酰化并包含大量酯键而形成空间位阻，阻碍了纤维素酶、半纤维素酶与底物的结合［9］，而乙酰酯酶可以催化水解乙酰基与半纤维素分子间形成的酯键，有利于破坏植物细胞壁的网状结构，同时对其他糖苷水解酶发挥作用起到促进作用［10］。在反刍动物的瘤胃液中，微生物分泌的乙酰酯酶，已被证明是消除饲料细胞壁中半纤维素交联酯键的关键酶［11］，并可以与纤维素酶、木聚糖酶协同作用，最大程度地利用自然界中的纤维类粗饲料资源［12］。课题组以瘤胃微生物为研究对象，构建了一组真菌菌系。本文研究了该菌系产生的乙酰酯酶的酶学性质，旨在为乙酰酯酶的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 瘤胃液取自吉林省皓月集团。将保温瓶预先灭菌，收集新鲜屠宰的肉牛瘤胃液，经4层纱布过滤后低温保存备用。实验所用化学试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基 种子培养基:每1 L含NaHCO35 g，葡萄糖 1 g，酵母膏 1 g，蛋白胨 1 g，L-半胱氨酸盐酸盐1.5 g，无细胞瘤胃液170 mL，缓冲液330 mL(A液、B液各165 mL);产酶培养基:每1 L含NaHCO35 g，酵母膏1 g，蛋白胨1 g，L-半胱氨酸盐酸盐1.5 g，无细胞瘤胃液170 mL，缓冲液330 mL(A液、B液各165 mL);缓冲液(pH为6.8):由A、B液组成，其中每1 L A液含KH2PO43 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，NaCl 6 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，(NH4)2SO43 g。每1 L B液含K2HPO4·3H2O 4 g;无细胞瘤胃液的获取:4层纱布过滤的新鲜牛瘤胃液，于4000 r/min，4℃离心30 min后取上清，－20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 乙酰酯酶活力分析 将厌氧真菌菌系接种在种子培养基，置于厌氧培养箱内39℃培养3 d。将活化后的菌系接种在发酵产酶培养基上。以无菌蒸馏水代替厌氧真菌菌系接种于培养基中同步培养作为空白对照。每天定时取样测定酶活力，连续7 d，分析乙酰酯酶活力动态变化。乙酰酯酶酶活力测定方法如下:于4℃、2000×g条件下将发酵液离心，得到的上清即为粗酶液。将2 mmol/L对-硝基苯乙酯、50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)和经适当稀释的粗酶液于39℃下保温15 min 后，50 μL 粗酶液中加入 50 μL 对-硝基苯乙酯和100 μL磷酸钠缓冲液，39℃下反应30 min，然后检测415 nm下的吸光度，依据对-硝基苯标准曲线计算出乙酰酯酶活力。1个酶活力单位(U)定义为在上述反应条件下，1 min内每1.0 mL酶液将1 μmol对-硝基苯从对-硝基苯乙酯中释放出来所需的酶量。

1.2.2 测定乙酰酯酶最适温度 将1.2.1中的反应温度用31、33、35、37、39、41 和 43 ℃替代，测出各温度下乙酰酯酶的活力大小，并且计算出相对酶活力。

1.2.3 测定乙酰酯酶最适pH 将1.2.1中使用的缓冲液用 pH 4.0～5.0柠檬酸钠缓冲液(50 mmol/L)，pH 6.0 ～8.0 磷酸钠缓冲液(50 mmol/L)和 pH 9.0～10.0甘氨酸-NaOH 缓冲液(50 mmol/L)替代，测出各pH下乙酰酯酶活力，并计算相对酶活力。

1.2.4 金属离子对乙酰酯酶活力影响 将4.0 mmol/L CoCl2、FeCl3、MgSO4、NiCl2、KCl、FeSO4和CaCl2储液和相同体积的粗酶液混合，39℃保温30 min后，测定乙酰酯酶活力，并计算相对酶活力。

2 结果与分析

2.1 乙酰酯酶活力动态分析

图1为乙酰酯酶活力动态分析。由图1可知，乙酰酯酶活力先持续增大，在第3天时达到最高酶活力0.96 U/mL，到第4天时开始下降。总趋势与陈静等［13］报道的瘤胃液中分离得到的细菌菌株RB1所产乙酰酯酶活力动态变化相似，但是其最大酶活力低于该厌氧菌系。曹阳春等［14］报道的瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis所产的乙酰酯酶活力最高为0.165 U/mL，也低于该厌氧菌系最高酶活力。这表明真菌菌系相对于单一菌株具有更高的产酶活力。

图1 乙酰酯酶活力动态Fig.1 Time courses of acetyl esterase

2.2 乙酰酯酶的最适温度

温度对乙酰酯酶活力的影响如图2所示。由图2可知，乙酰酯酶的最适温度为41℃。菌株RB1乙酰酯酶的最适温度为40℃［11］，瘤胃厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2乙酰酯酶的最适温度为30℃［15］。比较可以看出，来自瘤胃液中的不同微生物所产乙酰酯酶的最适温度差别较大。

图2 温度对乙酰酯酶活力的影响Fig.2 Effect of temperature on the activity of acetyl esterase

2.3 乙酰酯酶的最适pH

pH对乙酰酯酶活力影响如图3所示。由图3可知，该厌氧真菌菌系所产的乙酰酯酶最适pH为9.0，耐受pH值范围较窄。在pH低于6时，酶活力基本丧失，在pH 7.0时，相对酶活力为22%，pH 10.0时，相对酶活力为16%。在对Streptomyces sp.PC22的研究表明，所产乙酰酯酶的最适 pH范围为6.5～7.0［7］。菌株 RB1所产乙酰酯酶最适pH为8.0，略低于该真菌菌系所产乙酰酯酶的最适pH［9］。对瘤胃真菌菌株Neocallimastix sp.YQ2的研究显示，所产乙酰酯酶最适pH为8.0，低于本研究中乙酰酯酶最适pH［16］。不同来源的乙酰酯酶的最适 pH明显不同。

图3 pH对乙酰酯酶活力的影响Fig.3 Effect of pH on the activity of acetyl esterase

2.4 各种金属离子对乙酰酯酶活力影响

金属离子对乙酰酯酶的影响如表1所示。由表1可知，Mg2+、K+、Ca2+对酶有一定的激活作用，其中Mg2+对乙酰酯酶的促进作用最明显;而Co2+、Ni2+、Fe2+对酶有一定的抑制作用，其中Fe3+几乎完全抑制酶的活力。Degrassi等［17］研究了金属离子对Bacillus pumilus所产乙酰酯酶活力影响，10 mmol/L 的 Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ca2+明显抑制其活力，而 2 mmol/L时没有影响。Chungool等［11］研究 Streptomyces sp.PC22 在纯培养液中所产生的乙酰酯酶，发现0.1 mmol/L的Zn2+和 Cu2+抑制乙酰酯酶的活力，但 Mn2+、Ca2+、Co2+、Mg2+和 Ca2+没有明显的促进或抑制作用。说明不同来源的乙酰酯酶的酶学特性存在一定差异，综合文献报道及本文研究结果，Ca2+表现出激活或者抑制作用，而Co2+均表现为抑制作用。

表1 金属离子对乙酰酯酶活力影响Table 1 Effect of metal ions on the activity of acetyl esterase

3 讨论

本研究采用厌氧培养牛瘤胃液厌氧真菌菌系，对该菌系所产乙酰酯酶粗酶液，进行硫酸铵分级沉淀、透析、离子交换层析、凝胶过滤得到纯化后的乙酰酯酶，研究其酶学性质。由酶活力动态分析得出乙酰酯酶在产酶培养基培养至第3天酶活力达到最高，最高酶活力为0.96 U/mL，与其他文献对比得知，该菌系所产乙酰酯酶活力较高。该乙酰酯酶最适温度为41℃，最适pH为9.0，Mg2+、K+、Ca2+对酶有一定的激活作用，Fe3+对酶有很强的抑制作用。乙酰酯酶是消除细胞壁中半纤维素交联酯键的关键酶，与纤维素酶、木聚糖酶等具有协同作用，从而最大限度地降解木质纤维素物质，在降解含有大量乙酰木聚糖的农业有机废弃物过程中具有潜在的应用价值。

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