淫羊藿提取物对酵母朊病毒［PSI+］治愈的影响

李 辉，卜祥龙，窦 爽，郭晏华，张 波，宋有涛*

(1.辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳 110036;2.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

朊病毒是一类能引起疯牛病、绵羊瘙痒症和人克雅氏病等可传染性海绵样脑病的病原体，其致死率可达100%，迄今为止对于朊病毒疾病仍缺乏有效的治疗药物［1-2］。近年来，抗朊病毒药物筛选是国际上的研究热点。研究者通过构建动物模型、动物细胞模型、无细胞模型和酵母模型在抗朊病毒候选药物的筛选方面进行了大量研究，获得了戊聚糖多硫酸酯、刚果红、四磺酸基酞菁等几十种具有抗朊病毒作用效果的化合物［3-5］。其中，Bach等［6］的研究结果显示，一些天然药物化学组成成分如芳香性生物碱啡啶及啡啶衍生物类具有明显的抗朊病毒作用;另外，Rambold等［7］发现姜黄素和绿茶提取物中的主要多酚类物质表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)也具有一定的抗朊病毒效果。这暗示着在天然药物领域可能存在一些具有抗朊病毒活性的活性物质。在我国的中药研究领域，研究发现一些草药和几百种药方具有治疗帕金森症和阿尔茨海默症的临床效果［8-9］。这2种病症都与朊病毒疾病有相似的分子机制，然而，有关中药对酵母朊病毒影响的研究迄今鲜有报道。本文利用实验室改良的ΔERG6酵母朊病毒［PSI+］细胞模型，选取淫羊藿、千年健、生龙齿、刺五加、竹茹、熟地黄6种对阿尔茨海默症有一定疗效的菊科中药材作为研究材料。采取向酵母培养基中直接添加中药生药并灭菌处理的方式来研究中药对酵母朊病毒聚集的影响，筛选出具有抗朊病毒作用的药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 ΔERG6酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae:MATα kar1 SUQ5 ade2-1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52 erg6::KanMX，［PSI+］，7796-A菌系。

1.1.2 培养基(w/v，%) ①1/2YPD液体培养基:酵母浸出粉0.5，蛋白胨2，葡萄糖2，pH 自然，注意葡萄糖分装，在115℃高压蒸汽灭菌25 min，4℃保存;②1/2YPD固体培养基:酵母浸出粉 0.5，蛋白胨2，葡萄糖 2，琼脂粉 2，pH 自然，注意葡萄糖分装，115℃高压蒸汽灭菌25 min，4℃下保存;③YPAD固体培养基:酵母浸出粉1，蛋白胨2，腺嘌呤0.04，葡萄糖2，琼脂粉2，pH 自然，注意葡萄糖分装，115℃高压蒸汽灭菌25 min，4℃保存;④SD固体培养基:YNB-AA 0.7，葡萄糖2，琼脂粉2，pH自然，115℃高压蒸汽灭菌25 min，注意葡萄糖分装，待冷却到65℃时，按实验需要加入一定量的氨基酸及营养成分，其终浓度:Ade:20 mg/L，Ura:20 mg/L，Trp:20 mg/L，Leu:60 mg/L。轻轻摇匀后倒平板。

1.1.3 中药生药 淫羊藿、刺五加购于沈阳市东北大药房;千年健、生龙齿、竹茹、熟地黄购于草到祁州方成药店。

1.2 方法

1.2.1 含中药提取液培养基的制备 中药材经过粉碎后，准确称量中药粉末10 g置于圆底烧瓶中，加入100 mL蒸馏水，在95℃回流提取3 h，抽滤并回收滤液;称量滤液体积，添加1/2YPD液体培养基的各种成分配置成相当于含中药粉末的1/2YPD液体培养基。

1.2.2 淫羊藿醇提物的制备 淫羊藿经过粉碎后，准确称量中药粉末30 g置于圆底烧瓶中，加入300 mL 95%乙醇，在95℃回流提取3 h，抽滤并回收滤液;减压蒸发浓缩，浓缩液置于洁净小瓶中，于60℃过夜干燥，30℃放置至恒重并称量。用尽可能少量的5%DMSO溶解淫羊藿提取物，计算淫羊藿提取物的浓度为0.650 g/mL。

1.2.3 淫羊藿水提物的制备 淫羊藿经过粉碎后，准确称量中药粉末30 g置于圆底烧瓶中，加入300 mL蒸馏水，在95℃回流提取3 h，抽滤并回收滤液;减压蒸发浓缩，浓缩液置于洁净小瓶中，于60℃过夜干燥，30℃放置至恒重并称量。用尽可能少量的蒸馏水溶解淫羊藿提取物，计算淫羊藿提取物的浓度为0.425 g/mL。

1.2.4 遗传表型实验 ［PSI+］酵母细胞在24℃过夜活化培养后，调整菌液OD600至0.2左右，按10%接种量分别接种到含有指定化合物的1/2YPD液体培养体系，所有体系于24℃振荡培养5 d，在培养时间内间隔24 h更换培养基和化合物［10］。5 d后取培养液稀释后涂布于1/2YPD固体平板，平板于24℃培养7 d，观察菌落颜色变化，统计不同颜色菌落的比例。

2 结果与分析

2.1 6种中草药对酵母朊病毒的影响

图1 6种中草药抗酵母朊病毒的活性Fig.1 The activity of six kinds of Chinese herbal medicine against yeast prions

本实验室使用的［PSI+］酵母细胞ade2-1突变体中，ADE基因的翻译被人为突变的终止密码子阻断，因此［psi-］酵母细胞在少量Ade培养基(1/2YPD)上形成红色菌落，在缺乏Ade的选择性培养基(-Ade SD)上不能生长;而［PSI+］酵母细胞在1/2YPD上形成白色的菌落，在-Ade SD上可以生长［11］。利用上述酵母朊病毒细胞独特的遗传表型，检测淫羊藿、千年健、生龙齿、刺五加、竹茹、熟地黄6种中草药对朊病毒［PSI+］的治愈效果(图1)。

结果显示，千年健、生龙齿、刺五加、竹茹、熟地黄等5种中药在1～5 d内都没有出现红色菌落，而淫羊藿在5 d时出现部分红色菌落，为总菌落数的1%。从表型上看，淫羊藿作用后的红色菌落初步被认为是治愈的［psi-］，白色菌落为未治愈的［PSI+］。

2.2 定量分析淫羊藿水提物、醇提物对酵母朊病毒的治愈效果

为了深入研究淫羊藿对酵母朊病毒的治愈作用，对淫羊藿进行了水提和醇提，然后分别研究了0.032、0.065、0.0975 g/mL 浓度下对酵母朊病毒治愈的表型分布。如表1所示，0.0975 g/mL的淫羊藿醇提取物作用于［PSI+］细胞1～3 d后没有出现红色菌落，但作用5 d后出现了红色菌落，其比例为3%。由于淫羊藿醇提物的浓度大于0.0975 g/mL时有严重的抑菌作用，因此0.0975 g/mL是治愈的最佳浓度。而淫羊藿水提物并没有治愈效果。

表1 淫羊藿醇提物、水提物对［PSI+］的治愈效果Table 1 Effect of curing［PSI+］by using alcohol extract and water extract of Herba Epimedii

2.3 影印培养法检测淫羊藿醇提物对酵母朊病毒的作用效果

为了进一步验证淫羊藿醇提物的治愈效果，以排除假阳性的可能性，本实验利用影印培养法随机选取最佳浓度治愈下红色菌落，分别影印到YPAD、SD-Ade和1/2YPD平板上。由图2可以看出，被淫羊藿醇提物治愈的酵母细胞在1/2YPD培养基上为红色，在YPAD为白色菌落，而在缺乏Ade的SD培养基上不生长。这说明淫羊藿醇提物对酵母朊病毒［PSI+］的治愈结果不是由基因突变引起的颜色指示系统变化，是可靠的。

图2 影印培养法检测淫羊藿醇提物作用效果Fig.2 Detect positive results in different mediums

2.4 淫羊藿治愈后酵母［psi-］表型的传代稳定性

酵母朊病毒［PSI+］经淫羊藿治愈后形成的［psi-］表型在1/2YPD平板上生长为红色菌落，其脱离药物作用后可能会出现一些不稳定的表型，研究淫羊藿醇提物最佳治愈浓度作用5 d后出现的红色(R)菌落的传代稳定性。如图3所示，红色菌落传代36代后表型仍然稳定。这说明淫羊藿对酵母朊病毒［PSI+］的治愈是不可逆的。

图3 分析治愈后菌落表型的传代稳定性Fig.3 Generation stability of colony phenotype

3 讨论

利用ΔERG6酵母朊病毒［PSI+］细胞模型，从淫羊藿、千年健、生龙齿、刺五加、竹茹、熟地黄6种对阿尔茨海默症有一定疗效的菊科中草药中筛选出具有抗酵母朊病毒作用的淫羊藿，进一步的研究发现只有淫羊藿醇提物对酵母朊病毒具治愈作用。定量分析显示，淫羊藿醇提物的最佳治愈浓度为0.0975 g/mL，治愈率可达到3%。

据《中国药典》记载，淫羊藿性味辛、甘、温，归肝、肾经，具有温心阳、通心脉、化淤血等功效［12］。淫羊藿的主要成分是淫羊藿苷类、生物碱、黄酮类等，此类成分易溶于水、甲醇、乙醇等溶媒。结合此前发现的啡啶等芳香性生物碱的抗朊病毒作用，推测淫羊藿中的抗朊病毒的活性物质为生物碱类，但这需要下一步更精细的分离纯化研究的验证。

近20年来，研究者发现在酵母中至少存在8种安全无害的朊病毒［PSI+］、［URE3］、［PIN+］、［NU+］、［SWI+］、［OCT+］、［MOT3+］和［NSI+］，而且还发现了在酿酒酵母(S.cerevisiae)中存在19种具有朊病毒性质的蛋白。对比哺乳动物朊病毒，酵母朊病毒具有很多优点，因而在朊病毒的发生机理和抗朊病毒药物的筛选研究上倍受重视。基于 Wickner等发现酵母携带［PSI+］、［URE3］等与动物朊病毒聚集、传播机制相似的朊病毒，这些朊病毒具有各自的表型特征，Lindguist等进一步验证了酵母朊病毒对于动物细胞及个体的安全性，并发现酵母细胞具有与哺乳类细胞相似的朊病毒形成的胞内环境。2003年Blondel等利用野生型酵母朊病毒［PSI+］、［URE3］细胞为模型，在2500多种化学药物中筛出了6种抗酵母朊病毒聚集的化合物，并证明这些化合物在动物细胞中对于动物朊病毒同样有抗聚集作用。而且还证实了部分对哺乳动物朊病毒有效的朊病毒同样对酵母朊病毒具有一定的治愈效果。

朊粒的发现是继艾滋病病毒之后对人类提出的又一巨大挑战。目前，人们对这类传染性中枢神经机能退化症还缺乏有效的诊断和治疗手段。因此，朊粒病的预防显得尤为重要。可按传染病的要求进行预防:①消灭已知感染的哺乳动物 ，对人进行适当的隔离;②禁止食用可能污染的食物，对神经外科的操作器械进行严格处理，对器官移植要排除患朊粒病的可能;③对家族性疾病的家属应注意防止接触［13］。

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