六氯苯暴露导致梨形环棱螺脂质过氧化及DNA损伤研究

朱 祎，李家园，黄 俊，张清顺，周宇江，侯建军*



六氯苯暴露导致梨形环棱螺脂质过氧化及DNA损伤研究

朱 祎1,2，李家园1,2，黄 俊1,2，张清顺1，周宇江1，侯建军1,2*

(1 污染物分析与资源化技术湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002；2 湖北师范学院 生命科学学院，湖北 黄石 435002)

采用暴露实验方法，研究了不同浓度HCB（分别为0.0、2 .0、4.0、8.0、16.0 mg/L）在不同暴露时间(0-14d)下对梨形环棱螺肝脏和鳃中MDA、ROS含量以及DNA单链断裂程度的影响。结果表明：HCB对梨形环棱螺肝脏和鳃中MDA、ROS含量和DNA断裂均有明显影响。肝脏和鳃的MDA含量在HCB暴露过程中波动升高，直到在第4天或第7天达到峰值，然后MDA含量持续下降，到第14天 时，除了16.0mg/L剂量组与对照组无显著差异外，其他剂量组MDA仍处于显著被诱导状态。ROS水平随暴露时间和剂量增加而表现出升高的趋势，并且高剂量组较中低剂量组更早达到峰值，随着暴露时间的进一步延长，各剂量组ROS含量均有一定程度的下降，但在实验结束时仍然显著高于对照组。各剂量组DNA在HCB暴露起始时，出现一定程度的单链断裂现象，即F值迅速降低，随后F值有所上升，在第4天时F值达到最高点，显示DNA有一定程度的修复效应。接着F值呈现出持续下降的趋势，并且高剂量组的DNA单链断裂明显，表现出时间-剂量效应。结果提示，上述生物标志物在六氯苯对梨形环棱螺进行毒性暴露过程中的变化较为敏感，可以作为指示六氯苯对梨形环棱螺毒理效应的生物标志物。

六氯苯；梨形环棱螺；丙二醛；活性氧自由基；DNA单链断裂

0 前言

随着现代工业的迅猛发展，大量有机污染物源源不断地进入水体环境，使得水域环境污染日益严重。六氯苯(HCB)是一类典型的持久性有机污染物(persistent organic pollutants，POPs)，它具有高脂溶性、高致毒性、残留持久性、长距离迁移性和生物蓄积性等特点[1]，能在环境中持久残留，不易生物降解；能通过食物链的富集作用对生物造成严重影响；也能够经过长距离迁移到达远离污染源的地区，对接触该物质的生物造成损害[2]。梨形环棱螺属于中腹足目(Mesogastropoda)，田螺科(Cipangopaludina)，环棱螺属()，它在我国分布广，数量多，易培养，繁殖快，是富营养型湖泊的优势腹足类种群[3]，也是大型底栖生物的重要组成部分。研究表明众多环境污染物主要通过作用于线粒体而发挥其毒理效应[4,5]。HCB在体内代谢时，可通过氧化还原循环途径产生多种中间代谢产物，并伴随产生大量的活性氧自由基(如O2-，·OH，H2O2)[6]。HCB暴露还可通过诱导线粒体电子传递过程中电子漏的增加而增加活性氧的含量[7]。活性氧自由基若不及时被清除，就会诱发生物体内DNA 断裂、脂质过氧化等损伤[6]。因而，这些生物标志物的活性变化间接地反映了环境中氧化应激的存在，可作为环境污染胁迫的指标[8]。Peters等[9]认为将抗氧化酶活性单独作为污染引起氧化胁迫的生物标志物，其特异性和灵敏性不足，还应当测定前氧化物（Pro-oxidant）损伤（脂质过氧化、DNA断裂）。所以本研究选用梨形环棱螺作为实验材料，通过暴露实验方法研究不同浓度HCB对梨形环棱螺肝脏和鳃组织脂质过氧化指标(MDA、ROS)、肝脏和鳃组织中DNA单链断裂水平等毒理效应，初步探讨HCB对梨形环棱螺的的脂质过氧化、遗传损伤机理，为水环境POPs污染的早期诊断及生态风险评价提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物梨形环棱螺（Heude) 采集于湖北省黄石市磁湖，在实验室进行培养、繁殖。养殖池温度保持在 20-25℃，pH值控制在7.5左右。每天交替投喂新鲜的植物叶子和配合饲料。

1.2 仪器试剂

1.2.1 实验仪器

主要实验仪器设备包括：紫外可见分光光度计（美国Thermo公司）；高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；DIAX900微量匀浆机(德国Heidolph公司)等；凝胶成像分析系统(SYDR/2033)；常规垂直与水平凝胶电泳仪；核酸蛋白测定仪(EPPENDORF AG)；荧光分光光度计（Shimadzu RF-5301PC）等。

1.2.2 实验试剂

六氯苯(HCB)、蔗糖（Amresco）、Janus Green B (1%) (Fluka)、蛋白酶K、RNA酶、Hoechst dye 33258 (二苯丙咪唑)、二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、二甲基亚砜(DMSO)、标准DNA（上述药品均购自Sigma公司)，其余包括EDTA、Tris、β-巯基乙醇，戊二醛。

1.3 实验方法

1.3.1 HCB在体毒物毒性暴露实验

在急性毒性实验的基础上，以二甲基亚砜(DMSO)作溶剂，确定和配制用于动物在体暴露实验用的不同浓度的母液，DMSO在暴露实验溶液中的最终体积分数为0.01%。实验分组设置如下：对照组(CK，不含HCB，与其他组含等量DMSO)，HCB暴露组分别为2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L 4个浓度组，以下简称2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L剂量组。挑选比较活跃、体重在1.5 g 左右的动物进行实验。

实验在38cm×28cm×15cm 的水箱内进行。温度为24±1℃，自然光照，各梯度分别放入1.4—1.6 g健康、活动性强的梨形环棱螺 60只，将实验螺进行不同HCB浓度、不同时间的毒性暴露实验，每个浓度梯度分别设置3个平行的水族箱。实验期间的管理与饲养繁殖期间一致，隔天换水一次，每次换水一半，换水时分别加入含有与HCB毒性暴露实验中浓度一致的曝气自来水。实验开始后分别于1d、2d、4d、7d、10d 和14d 取样，在每个浓度梯度的水族箱中各随机选取6只实验用螺，用纱布擦干螺的体表，置冰盘内进行解剖，分离其肝脏和鳃，用滤纸吸干，置于2.0 mL离心管内，液氮速冻后于－80℃冰箱中保存备测。

1.3.2 各类生物标志物的测定方法

（1）酶样的制备

取肝、鳃组织约0. 1～0. 2 g，以1: 20 (质量浓度)的比例加入预冷的0.01 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，冰水浴中低速匀浆，4℃下离心 (10000 g，10 min)，取上清液，即为组织酶提取液。

（2）MDA的测定

MDA的测定采用试剂盒(南京建成生物工程研究所，A003-1)，上述蛋白质含量均采用考马斯亮蓝试剂盒测定（南京建成生物工程研究所第一分所，A045-2）。

（3）ROS的测定

参照Curtin等的方法稍加改进[10]。反应体系为：1.95 mL线粒体液，加0.05 mL( 1 m mol·L-1) DCFH-DA，混匀，于37 ℃温浴30 min，用荧光分光光度计(Ex＝485nm，Em＝538nm，狭缝＝1.5 nm)测其荧光强度( FI)值，单位以FI·mg-1蛋白表示。

（4）DNA完整性测定

按照碱解旋程序分析DNA的单链断裂情况[11]，碱解旋后的DNA样品中加入3 mL0. 2 mol.L-1磷酸钾缓冲液(pH=6.9)，30μL Hoechst dye 33258 (二苯丙咪唑，0.1 g·L-1)，混匀后置于暗处反应15 min 后，用荧光分光光度计在Ex: 360 nm，Em: 450nm 处测定吸光值。DNA完整性通常以F值表示，F值的计算公式如下[12]：

F =（XauDNA- XssDNA)/(dsDNA - XssDNA)

上式中，X为荧光值，dsDNA 为双链DNA，ssDNA为单链DNA，auDNA为碱解旋后的DNA。

1.3.3 数据处理方法

试验结果采用平均数±标准误（x ±s.）表示，全部试验数据均采用SPSS 15. 0统计软件包进行统计分析。各组间的显著性检验采用单因素方差分析，对照组与各剂量组的两两比较采用LSD法，抗氧化指标间的相关分析采用Pearson相关分析，<0.05表示差异显著，<0.01表示差异极显著。绘图软件采用Sigmaplot13.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度HCB对梨形环棱螺肝脏和鳃MDA含量的影响

图1A显示，各HCB剂量组其肝脏组织中MDA含量在暴露前2d内经历了小幅度波动，表现为先上升后下降；到第2d时，各剂量组又降至对照组附近（>0.05）；然后各组MDA的含量被再度诱导，显著升高直至达到各自峰值，并且其最高值与各剂量呈负相关。此时，与对照组相比，MDA含量上升了180%－230%（<0.01）；随后各组MDA含量受到抑制持续下降，至第14d时，中低剂量组的MDA含量比对照组高出100%－170%，但仍都处于极显著诱导状态（<0.01），而16.0 mg/L剂量组肝组织的MDA含量仅略高于对照组（>0.05）。

在图1B中，在HCB暴露的前2d，各剂量组鳃组织中MDA含量均被诱导升高；之后除16.0 mg/L剂量组的MDA含量存在些许波动，其余各剂量组MDA含量均保持上升趋势，直至达到各自的峰值。从图中可以看出，2.0 mg/L剂量组达到峰值的时间最晚，但峰值最高，其上升率约达到对照组的240%；其中16.0 mg/L剂量组的峰值最低，仅比对照组高出120%，但各剂量组MDA含量均处于显著诱导状态（<0.01）。然后各剂量组MDA含量从峰值开始下降，至第14d时中低剂量组的MDA含量约为对照组的128%－152%，仍显著高于对照组（<0.05）；16.0 mg/L剂量组MDA含量也处于诱导状态，但仅略高于照组（>0.05）。

2.2 不同浓度HCB对梨形环棱螺肝脏和鳃组织线粒体中ROS含量的影响

在整个实验过程中各剂量组的肝脏线粒体中ROS含量呈现出先上升后下降的趋势,在HCB暴露的前阶段，ROS含量呈剂量依赖性升高。HCB暴露的第1d，2.0 mg/L剂量组ROS含量仅上升了15%，4.0mg/L剂量组ROS含量上升了28%（<0.05），8.0与16.0 mg/L剂量组已与对照组存在极显著差异(<0.01)。之后，各剂量组ROS含量持续上升直至达到各自的峰值，此时各剂量组ROS含量均与对照组有显著或极显著差异，并且16.0 mg/L剂量组ROS含量已达到对照组的179%。随着暴露时间的进一步延长，各剂量组的ROS含量都表现出一定程度的波动，总体上均呈下降趋势，到第14d时各剂量组仍然与对照组有显著或极显著的差异，并且其ROS含量与各剂量呈正相关(表1)。

表 1 HCB对梨形环棱螺肝脏中ROS含量的影响 (FI.mg-1)

* 处理组和对照组间差异显著(<0.05) ; **差异极显著(<0.01). 以下相同。

如表2，HCB对鳃线粒体中ROS含量影响趋势与肝脏中极为相似，但诱导程度更加显著。除了2.0 mg/L剂量组在暴露的第1d仅上升了20.4%（>0.05），其它各剂量组在实验开始时ROS含量就显著上升。随后各剂量组ROS含量呈剂量依赖性上升直至达到各自的峰值，此时各剂量组ROS含量为对照组的167%~195%（<0.01）。达到峰值后，各剂量组的ROS含量均开始一定程度的下降；在第10d-14d，ROS含量基本维持相对稳定，其下降幅度不超过2%；到第14d时，各剂量组的ROS的上升率为对照组的55%~89%，极显著高于对照组（<0.01）。

对于生产危险化学品的特种化工过程，安全性应放在首位。完全依赖人员经验的传统式安全防护技术，在工艺介质危险性大、工艺过程日趋复杂的形势下，已不能很好地满足特种化工过程的安全管控需要。随着国内外安全科学与工程技术的研究、发展和应用的日益成熟，按照安全工程技术原理和方法对危险的特种化工过程进行安全管控，已逐步成为国内外化工安全领域的通行做法[1-5]。

表2 HCB对梨形环棱螺鳃中ROS含量的影响 (FI.mg-1)

2.3 HCB对梨形环棱螺肝脏和鳃中DNA单链断裂的影响

表3显示，在HCB暴露的第1 d各剂量组梨形环棱螺肝脏中DNA单链均呈现出一定程度的断裂（(表现为F值均低于对照组），其断裂程度呈剂量依赖性关系，其中高剂量组（16.0 mg/L）F值下降了43.4% (< 0.05)，其余各组DNA单链断裂并不明显。随后F值均有一定程度的上升，提示断裂的DNA有一定程度的修复。其中，低剂量组(2.0、4.0 mg/L)F值上升的幅度不超过8%，而高剂量组(8.0、16.0 mg/L组)F值上升的幅度在40%左右。随着HCB暴露时间的进一步的延长，F值保持下降趋势，直至第14 d。此时，高剂量组F值仅为对照组的42.5%~53.5% (< 0.05)，表明DNA单链断裂显著；而低剂量组与对照组相比仅下降了26%~41%（> 0.05）。

HCB胁迫对梨形环棱螺鳃DNA单链的影响趋势与其在肝脏中较为一致但程度相对较小。在HCB暴露的第1d，各剂量组DNA单链均呈现一定程度的断裂且其断裂程度同样呈剂量依赖性关系(表现为F值均低于对照组，且依次降低，见表4)，其中8.0、16.0mg/L剂量组与对照组相比下降了37%~41% (<0.05)。其余各组均与对照组无显著差异。随后，高剂量组(8.0、16.0mg/L)较低剂量组(2、4 mg/L)的F值有更大幅度的回升，回升后的F值与对照组均无显著差异。随着HCB暴露时间进一步延长，各剂量组F值持续降低，显示DNA单链断裂程度继续加重。此间，除了8.0mg/L剂量组在第14d，16.0mg/L剂量组在第7、10、14d和对照组相比有显著差异外，其余各组在此阶段与对照组均无显著性差异。至暴露到14d时，低剂量组(2, 4mg/L)的F值仅下降25%~27%(>0.05)，而高剂量组(8，16mg/L)F值则下降48%~63%(<0.05)。

表3 HCB对梨形环棱螺肝组织中DNA损伤的影响

* 处理组和对照组间差异显著(<0.05) . 以下相同。

表4 HCB对梨形环棱螺鳃组织中DNA损伤的影响

3 讨论

3.1 不同浓度HCB对梨形环棱螺肝脏和鳃组织的脂质过氧化效应

采用HCB暴露时，生物体内可产生大量活性氧自由基，当产生的活性氧自由基不能被及时清除时，常可能通过攻击膜不饱和脂肪酸而引起脂质过氧化，分解生成MDA等物质，从而使生物大分子之间发生交联，聚合而发生功能异常[13]。MDA是脂质过氧化反应的终产物，其含量可反映脂质过氧化程度[14]。本试验中，肝脏MDA含量在HCB暴露1~2d 时，其含量下降，可能是由于在短时间内HCB胁迫诱导了抗氧化防御系统，活性氧被及时清除，机体免受氧化损伤。鳃中MDA自染毒开始以及肝中MDA染毒2d后，MDA含量显著持续上升直至各剂量组达到峰值，表明HCB已引起机体发生脂质过氧化产生氧化损伤，这是由于HCB持续胁迫，活性氧生成量超出抗氧化系统的清除能力，抗氧化防御系统正常功能发生紊乱，自由基不能被及时清除，大量积累，从而产生生物氧化胁迫作用，引发脂质过氧化，导致MDA含量升高。

另外，我们在实验中发现，2.0 mg/L剂量组虽较晚达到峰值，但其峰值要高于其他剂量组，推测低浓度HCB长期诱导亦可产生较大损伤。达到峰值后，各剂量组MDA含量持续下降，可能是抗氧化防御系统中多种成分参与了自由基的清除及GSH等与脂质过氧化的产物MDA直接结合。本实验结果显示，HCB暴露对螺线粒体产生了氧化胁迫，而螺体存在有效的机制来减轻氧化损伤程度。随着自由基的不断生成，生物体发生氧化应激来适应逆境胁迫，这种平衡的改变会导致脂质过氧化产物MDA的累积，而MDA本身又会加剧细胞的损伤，抑制抗氧化系统的活性[15]，所以本实验中，低剂量组MDA含量最终仍显著高于对照组。16.0 mg/L剂量组MDA含量与对照组非常接近，可能是因为体内某些抗氧化指标的活性因代偿性应激反应而不断升高，继而抗氧化能力逐渐提高，脂质过氧化过程受到抑制，导致其产物MDA含量减少。

3.2 不同浓度HCB导致梨形环棱螺氧化胁迫机理

ROS是细胞代谢不可避免的产物。近年来研究表明，ROS主要产生于线粒体的氧化呼吸过程中[16]。本实验中，采用HCB暴露后，ROS含量持续上升，并且高剂量组（8.0、16.0 mg/L）较中低剂量组（2.0、4.0 mg/L）更早达到峰值，表明ROS含量同时受到HCB暴露时间和暴露浓度的影响，表现出时间－剂量效应特征。根据我们实验的结果和前文讨论，结合Sashwati等的报道[17]，我们推测，六氯苯暴露可诱导梨形环棱螺肝脏和鳃线粒体中抗氧化酶活性显著增加，而线粒体中单加氧酶活性被显著抑制，因此HCB暴露可能导致线粒体电子传递过程中的电子泄露增加，漏出呼吸链的电子未能用于ATP 合成，而是参加了超氧自由基的产生和代谢，即引起氧单电子还原而产生超氧阴离子自由基[7]，所以导致ROS等自由基大量产生。另外，HCB在螺体内代谢时可进行氧化还原循环，同样也伴随着活性氧自由基大量产生[6]。HCB导致ROS大量生成的同时，会引起机体的氧化应激，诱导SOD等抗氧化酶活性增强，ROS被大量清除，导致其含量迅速降至正常水平或略低于正常值。但随着暴露时间进一步延长，进入体内的HCB增多，诱导产生过量活性氧，而消除活性氧的抗氧化酶系统的协调性遭到破坏，进而引起活性氧大量积累。此现象与实验后期“ROS含量虽有一定程度的下降，但与对照组有显著或极显著差异”这一结果相吻合。另外，过多的电子泄漏会导致氧自由基代谢失衡，并产生较多的活性氧，进而引起线粒体突变、损伤[18]，氧化磷酸化系统受损会影响与呼吸链有关的酶的活性，导致经电子漏生成的O2-会显著增多，使线粒体ROS过量产生，此时抗氧化酶的活性并没有太大改变[19]，过量ROS不能被完全清除而最终明显高于对照组，最终导致机体遭受严重的过氧化胁迫。

3.3 HCB导致梨形环棱螺遗传损伤机理

DNA单链断裂是一种重要的DNA损伤。本实验采用碱解旋法检测了暴露于HCB后梨形环棱螺肝脏和鳃组织中DNA的单链断裂程度。由于HCB进入螺体内后，在代谢过程中可形成多种中间代谢物，这些中间代谢产物多为活性极高的亲电化合物，可与DNA分子反应形成DNA加合物，从而诱导多种类型的遗传损伤如DNA单链的断裂[20]；另外，HCB暴露导致活性氧积累，同样可以也可引起DNA单链断裂。本实验在暴露的第1d内，就在各剂量组检测到了DNA单链断裂现象。由于体内存在有GST等解毒酶，可通过催化GSH与亲电中间代谢物结合，减少DNA加合物形成的可能性，因此断裂的DNA会出现一定程度的修复，从而减轻了DNA的损伤程度[21]。当HCB暴露时间延长，ROS进一步增加，SOD等抗氧化酶活性降低，氧自由基积累，过量积累的ROS不能被及时清除，将导致螺体鳃和肝脏组织的氧化损伤和自由基介导的过氧化作用加剧，氧化损伤产物增加又会进一步削弱抗氧化酶系修复损伤的缓冲能力[22]；产生的过量活性氧可以直接攻击DNA，引起细胞的氧化性损伤[23]。本实验中的F值持续下降，直至第14d；随着暴露时间延长，高剂量组（8.0、16.0mg/L）较中、低剂量组（2.0、4.0 mg/L）F值的下降幅度更大，提示DNA单链同时受到暴露时间和暴露浓度的影响。

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Exposure to Hexachlorobenzene in Bellamya purificata Inducing Lipid Peroxidation and DNA Damage

ZHU Yi1,2, LI Jia-yuan1,2, HUANG Jun1,2, ZHANG Qing-shun1, ZHOU Yu-jiang2, HOU Jian-jun1,2

(1 Hubei Key Laboratory of Pollutant Analysis & Reuse Technology, Huangshi Hubei 435002, China; 2 College of Life Science, Hubei Normal University, Huangshi Hubei 435002, China)

An exposure experiment was conducted to study the effects of HCB at different concentrations (0, 2.0, 4.0, 8.0, 16.0 mg / L) on levels of MDA and ROS as well as the extent of DNA single-strand breaks in liver and gills of Bellamya purificata at different exposure time (0-14d) in vivo. The results showed that HCB had significant influence on them.The concentrations of MDA increased fluctuatly during exposure of HCB until they reached peak value on 4th day or 7th day, and then they decreased on 14th day. There was significant difference between HCB exposure and the control group except 16.0 mg/L HCB group. The concentration of ROS tended to be enhanced with the exposure time and dosage increasing, ROS of high dosage group reached its peak earlier than that of low dosage. The content of ROS decreased in a certain extent with the exposure time further increasing, and they were still significantly higher than that of control group on 14th day. DNA single-strand breaking of each HCB group occurred in a way at the beginning of exposure，that was the F value decreased quickly, and then increased slightly till it reached an upper value on 4th day, which indicated that there were some recovering of the breaking DNA. Subsequently, F value of all HCB groups keeped decreasing, and more breaking appeared in high-dose-HCB groups. There was a time-dosage effect between the HCB exposure and DNA single-strand breaking. All these results suggested that biomarkers in this study were sensitive during HCB exposuring, which could be used as biomarkers of evaluating toxicological effects of HCB on B. purificata.

Hexachlorobenzene; Bellamya Purificata; Malonyldialdehyde; Reactive Oxygen Species; DNA Single-Strand Breaks

X17

A

2095－414X(2013)03－0088－07

湖北省教育厅2010年度重点项目（No.D20102505），湖北师范学院2008年度人才项目(No.2008F14)，污染物分析与资源化技术湖北省重点实验室开放课题(No.KY2013G11)，中国水产科学研究院淡水生态与健康养殖重点开放实验室项目(No.2007FEA0205），中国水产科学研究院内陆渔业生态环境和资源重点开放实验室项目（No. YM2007－03）.

侯建军（1966-），男，教授，博士，研究方向：水域生态学及分子生态毒理学.