HBV基因型、前S/S基因突变与HBV母婴传播免疫预防失败的关系*

尹玉竹， 张培珍， 腾奔琦， 周 瑾， 侯红瑛

(中山大学附属第三医院妇产科， 广东 广州 510630)

HBV基因型、前S/S基因突变与HBV母婴传播免疫预防失败的关系*

尹玉竹， 张培珍， 腾奔琦， 周 瑾， 侯红瑛△

(中山大学附属第三医院妇产科， 广东 广州 510630)

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型、前S/S基因突变与HBV母婴传播免疫预防失败的关系。方法选择血清HBsAg阳性且HBV DNA定量≥1×1010IU/L的孕妇及其新生儿，以新生儿是否发生免疫预防失败将孕妇分为免疫预防失败组(15例)和免疫预防成功组(45例)，采用PCR扩增直接测序法对2组孕妇血中HBV进行基因分型和前S/S基因突变的检测，对比分析2组的不同。结果(1)基因型：2组孕妇血中HBV的基因型均为B和C型，均以B型为主，2组基因型分布相比，差异无统计学意义(P>0.05)。(2)突变率：HBV 前S/S基因2个片段的突变率在免疫预防失败组与免疫预防成功组间相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；而B基因型与C基因型间相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；但在同一基因型内，2个片段的突变率在免疫预防失败组与免疫预防成功组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。对HBV 前S/S基因2个片段的遗传树分析也显示不同基因型的基因突变率不同，但同一基因型的突变率在2组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)突变热点：在免疫失败组的4个病例中发现4个突变热点：529G-A、530A-G、826A-G1和166het-dupC各1例；在免疫成功组的6个病例中发现3个突变热点：A530T 1例，A530G 2例， T531C 3例。结论(1)不同HBV基因型间前S/S基因突变率不同。(2)HBV前S/S基因突变普遍存在，但并不是每个突变都与母婴传播免疫失败有关，仅分析基因突变率对研究免疫失败并无意义，寻找与免疫失败有关的特异性突变位点可能更有意义。

肝炎病毒,乙型； 母婴传播； 免疫预防失败； 突变

对 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)阳性母亲所分娩的新生儿进行乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗联合免疫，阻断的成功率高达95%以上，但仍有免疫预防失败的发生。研究发现除HBV DNA定量高水平外[1]，HBV基因突变也是影响免疫失败的重要危险因素[2]，尤其前S/S基因突变可使免疫表位发生改变，出现疫苗逃避突变株(vaccine escape mutant，VEM)，导致当前免疫方案失败。HBV基因型与HBV感染及临床治疗结局密切相关，不同的基因型，HBV基因突变位点差异较大[3-4]。本研究将在HBV基因分型的基础上，对比分析HBV DNA定量高水平孕妇免疫预防失败组和免疫预防成功组HBV前S/S基因位点的突变率及突变热点的不同，寻找与免疫失败有关的突变热点，为进一步降低HBV的母婴传播率提供分子生物学基础。

材 料 和 方 法

1研究对象

选取 2008年6月至2011年3月在广州市中山大学附属第三医院定期产检、住院分娩和随访的血清HBsAg阳性且HBV DNA高水平的孕妇及其新生儿。孕妇入选标准：(1)HBsAg阳性且持续阳性≥6个月；(2)HBV DNA定量≥1×1010IU/L；(3)肝、肾功能正常，血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎系检查呈阴性；(4)孕周：28～42周；(5)B超排除胎儿畸形。排除标准：(1)合并自身免疫性疾病；(2)孕期使用抗病毒药物、免疫调节剂、细胞毒性药物，或长期使用糖皮质激素类药物；(3)所分娩的新生儿出生后未能及时进行主被动联合免疫的孕妇。

2方法

2.1分组 入选孕妇在分娩前24 h内留取静脉血2 mL；新生儿于出生6 h内尽早肌肉注射乙肝免疫球蛋白200 IU，并按0、1、6方案接种重组酵母乙肝疫苗10 μg，分别于出生及7月龄时各留取外周静脉血2 mL，追踪其HBV血清学标志物及HBV DNA定量结果。以新生儿出生时HBsAg和/(或)HBV DNA阳性并持续阳性至7月龄作为免疫预防失败标准[5]，研究期间共观察到15例婴儿发生免疫预防失败，将分娩免疫预防失败婴儿的孕妇作为免疫预防失败组，按1∶3随机选取同期分娩免疫预防成功婴儿的孕妇45例作为免疫预防成功组，对比分析2组孕妇血中HBV基因型、前S/S基因突变率及突变位点的不同。2组孕妇平均年龄分别为(27.87±4.93)岁和(28.93±2.79)岁，平均分娩孕周分别为(38.00±4.49)周和(38.92±1.46)周，2组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2方法 采用血清基因组 DNA 抽提试剂(广州达安基因公司)抽提血清HBV DNA(按说明书操作)。采用PCR扩增直接测序法进行HBV基因型、前S/S基因突变率及突变位点的检测。因前S/S基因片段较大，将其分为2个片段分别扩增，片段1为部分前S及部分S区，片段2为a决定簇及周围部分S区，2个片段长度均为800 bp左右。PCR反应体系为25 μL，主要包括:血清病毒DNA 5 μL、Platinum Taq DNA聚合酶0.2 μL、10× PCR缓冲液(不含Mg2+) 2.5 μL、10 mol/L dNTP混合液2 μL、10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL (片段1上、下游引物分别为5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’,5’-GGACAAACGGGCAACATACC-3’；片段2上、下游引物分别为5’-GGATGTGTCTGCGGCGTTTTAT-3’,5’-TGCGTCAGCAAACACTTGGC-3’)。PCR 扩增采用 ABI 2700 扩增仪，PCR 扩增条件如下:95 ℃变性5 min，随后45个循环的94 ℃ 30 s， 55.5 ℃ 30 s， 72 ℃ 50 s；最后于 72 ℃ 延伸 10 min。采用含 0.5 kg/L溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳来鉴定 PCR 扩增产物。以DNA 标志物 M1200-50(北京索莱宝科技有限公司)为DNA片段条带大小及浓度标准品，采用凝胶成像分析系统UVP GDS-8000分析PCR 扩增的片段长度。将所得片段送上海英潍捷基公司进行DNA测序。

从GenBank随机下载中国广东省的HBV基因全序列8条作为参考序列(AY817515.1、DQ448628.1、DQ478896.1、DQ478899.1、DQ478901.1、NC_003977.1、Y18858.1和AY217370.1)。采用Chromas软件评估测序结果，DNAMAN软件比对DNA序列，以S基因区的突变位点对血清样本HBV进行基因分型，并利用距离法构建同源树进行同源性分析，寻找 HBV 前S及S区的不同样本间及不同基因片段间突变模式，根据既往已发表文献，寻找所得序列中可能与免疫预防失败相关的基因突变热点。

3统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，定量资料采用t检验或秩和检验，定性资料采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1HBV基因型分析

免疫预防失败组与免疫预防成功组的基因型均为B和C基因型，未见其它基因型，并均以B基因型为主(80%vs60%)，2组基因型分布相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1免疫预防失败组与免疫预防成功组HBV基因型分布的比较

Table 1. Comparison of genotype distribution between case (immunoprophylaxis failure) and control groups

GroupGenotypeBGenotypeCB2B4B7C1C2C5Case1020030Control2241981

2突变率分析

对比2组孕妇血中HBV 前S/S基因2个片段的突变率，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。考虑基因型对突变率的影响较大，将所有B基因型与C基因型 HBV前S/S基因2个片段的突变率进行对比，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2；但基因型相同时，2个片段的突变率在免疫预防失败组与免疫预防成功组间相比，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。对2组孕妇血中HBV 前S/S基因2个片段的遗传树分析提示：B、C 2个基因型所形成的2个子簇集间的同源性<95%，说明它们分别属于不同的基因型。而在每个子簇集内，2组的病毒株并没有出现明显的簇集聚集性，符合之前的统计推断，即不同基因型的基因突变率不同，但相同基因型的突变率在2组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

表2 HBV 前S/S基因2个片段的突变率在不同组别以及不同基因型间的比较

Data were expressed as median and compared using Mann-WhitneyUtest.

表3同一基因型HBV前S/S基因2个片段的突变率在2组间的比较

Table 3. Comparison of mutation rates in HBV PreS/S gene between case and control groups with the same genotype

GroupCaseControlZPGenotypeBGenefragment12.002.00-0.25>0.05Genefragment29.509.00-0.80>0.05GenotypeCGenefragment111.005.00-0.87>0.05Genefragment214.0024.00-1.31>0.05

Data were expressed as median and compared using Mann-WhitneyUtest.

3突变热点分析

在免疫预防失败组4个不同的病例中发现4个不同的突变热点：G529A、A530G、A826G和1f66het-dupC 各1例；在免疫预防成功组6个病例中发现3个不同的突变热点：A530T 1例，A530G 2例， T531C 3例。

讨 论

HBV的基因型与病毒的生物学性状、疾病的发展和临床治疗效果密切相关[3, 6]。大量研究认为，B、C 2种基因型传播方式均以母婴传播为主，但C基因型有更高的HBV DNA定量水平和基因突变率[7]，因此认为C基因型可能更容易发生母婴传播免疫阻断失败[5]。在本研究中，仅见B和C 2种基因型的分布在免疫预防失败组和免疫预防成功组间无统计学差异(P>0.05)，均以B基因型为主，与既往研究中C基因型更易发生免疫失败有所不同，可能与以下两方面有关：(1)HBV基因型存在区域性分布特征[4]，据文献报道，中国南方以B基因型为主，北方则以C基因型为主[8-9]。但既往研究的对象主要源于中国北方和韩国，即以C基因型流行为主的地区，因此研究结果可能并不适合中国南方人群。(2)免疫预防失败与高HBV DNA定量密切相关[1]，本研究纳入的研究对象为高HBV DNA定量的孕妇；而既往研究并未界定HBV DNA水平，造成了研究结果有所不同。由此推测，在HBV DNA定量≥1×1010IU/L前提下，B和C基因型均易发生母婴传播， B 基因型的母婴传播率不一定低于C基因型，甚至可能高于C基因型，但目前有关B基因型的母婴传播研究资料较少。

HBV的前S及S基因区，包括了与肝细胞的结合位点以及联合免疫作用位点。有研究认为HBV 在联合免疫的免疫压力下，发生前S及S区基因位点突变，导致相应氨基酸改变，使抗体不能识别表面抗原造成免疫预防失败[10]。但在本研究中，免疫预防失败组和免疫预防成功组孕妇血中的HBV在前S及S基因区2个片段的突变率并无差别。考虑基因分型对病毒突变率的影响，本研究结合病毒基因型对突变率进一步分析，发现B和C 2种基因型的突变率不同，但同一基因型内，前S/S基因突变率在免疫失败组和免疫成功组间并无差异；对HBV 前S/S基因2个片段的遗传树分析也发现，B、C 2种基因型分别形成了2个不同的子簇集，在这各自的子簇集内，2组病毒株并没有出现明显的簇集聚集性。由此推测，基因突变率与基因型密切相关，但与是否发生免疫预防失败无明显相关性。对于既往研究认为免疫预防失败与免疫预防成功组在前S及S基因区的突变率有统计学差异[11]，可能与2组间基因型分布比例不同有关。

Figure 1. Homology tree model based on PreS2/S gene fragment 1 and fragment 2. M：case group；C：control group；B1～7：genotype B and subgenotypes；C1～5：genotype C and subgenotypes.

图1HBVPreS及S基因2个片段的同源树簇集分析

HBV 的S基因区编码表面蛋白，其第124～147位氨基酸为“a抗原决定簇”，不仅决定HBV的血清学亚型，也是宿主对HBV进行体液免疫最重要的抗体结合位点。有研究认为，若在该区域内发生突变可导致HBV表面抗原发生改变，使中和性抗体不能结合表面抗原造成免疫逃避和免疫预防失败[12]。但也有研究证实，该基因区域为双环结构，十分保守，即使存在碱基突变，大多数位于密码子的第3位，一般不引起相应氨基酸的改变[13]；在发生HBV母婴免疫预防失败的病毒株并中没有检测到 a决定簇的突变位点[14]。本研究中，免疫预防失败组中检测的突变位点G529A和A530G决定氨基酸位点T126I/A，在免疫预防成功组中检测到的突变位点A530T、A530G和T531C也决定该氨基酸位点，并且都位于S基因区的a决定簇，因此，其与免疫预防失败的相关性尚难以确定。另外1例ntA826G→rtL233V仅发生在免疫预防失败组中，其可改变L233V氨基酸位点。此位点位于S基因区的非a决定簇区，同时位于逆转录酶编码区，为拉米夫定、替比夫定及恩替卡韦的共同耐药突变位点，有研究认为此位点不仅可引起对抗病毒药物耐药，还同时为免疫逃避突变位点，可导致新生儿免疫失败[15]。鉴于此病例并未进行抗病毒治疗，推测此突变可能源于水平感染或自发突变，故可存在于HBV携带人群，形成新的传染源，但因本研究中仅此1例，此基因位点突变是否与母婴传播联合免疫预防失败相关，还需在今后的研究中进一步探讨。

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RelationshipbetweenHBVgenotype,PreS/SgenemutationandimmunoprophylaxisfailuretopreventHBVmother-to-childtransmission

YIN Yu-zhu, ZHANG Pei-zhen, TENG Ben-qi, ZHOU Jin, HOU Hong-ying

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:yzzst2011@163.com)

AIM: To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV) genotype, PreS/S gene mutation and immunoprophylaxis failure to prevent HBV mother-to-child transmission.METHODSPregnant women with positive HBV surface antigen (HBsAg) and HBV DNA≥1×1010IU/L were divided into case group (15 cases) and control group (45 cases) according to their neonates with immunoprophylaxis failure or not. The genotypes of HBV and the mutation rate and mutational hot spots in PreS/S gene were detected by PCR amplification technique in the two groups.RESULTS(1) Genotypes B and C of HBV were detected in both case and control groups, and the majority of HBV genotype was B in the two groups. Genotype distribution difference between case and control groups was not statistically significant (P>0.05). (2) There was no significant difference in the mutation rate of PreS/S gene between case and control groups (P>0.05). The mutation rates of PreS/S gene between genotypes B and C were significantly different (P<0.05), but when the HBV genotype was the same, the mutation rate of PreS/S gene had no significant difference between case and control groups. Homology tree model based on PreS2/S gene formed genotype B and genotype C clusters, and in each cluster, the sequences of case and control groups did not formed smaller different clusters further. (3) 529G-A, 530A-G, 826A-G1 and 166het-dupC were hot spots of mutation in PreS2/S gene and were found in 4 cases in case group, respectively. A530T (1 case), A530G (2 cases), T531C (3 cases) were found in control group.CONCLUSION(1) The mutation rates of PreS/S gene are different in various genotypes. (2) The mutation in PreS/S gene of HBV is prevalent, but not all of the mutations are related to immunoprophylaxis failure to prevent HBV mother-to-child transmission. To find mutational hot spots which are related to immunoprophylaxis failure is more important.

Hepatitis B virus; Mother-to-child transmission; Immunoprophylaxis failure; Mutation

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1615- 05

2013- 06- 08

2013- 08- 09

广东省自然科学基金资助项目(No.05001670)；广东省科技计划(No.2008B060600023)

△通讯作者 Tel: 020-85252285; E-mail: yzzst2011@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.013