Ghrelin对脓毒症肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞及肺组织iNOS表达的影响*

何婉媚， 曾 勉， 易 慧， 蒋玉洁， 常敏婵

(中山大学附属第一医院MICU，广东 广州 510080)

Ghrelin对脓毒症肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞及肺组织iNOS表达的影响*

何婉媚， 曾 勉△， 易 慧， 蒋玉洁， 常敏婵

(中山大学附属第一医院MICU，广东 广州 510080)

目的观察ghrelin对脓毒症肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞及肺组织诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达的影响。方法SD雄性大鼠分为假手术组、脓毒症组及ghrelin治疗组，前2组各设术后6 h、12 h和20 h亚组。通过盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)建立脓毒症模型，ghrelin治疗组于术后3 h及15 h腹腔注射ghrelin，术后20 h取材。各组按术后既定时间行支气管肺泡灌洗收集肺泡巨噬细胞，RT-PCR检测肺泡巨噬细胞中iNOS mRNA的表达水平。另一部分大鼠则在术后20 h采集右肺，行肺病理学检查及Western blotting检测肺组织iNOS蛋白表达。结果脓毒症组在CLP术后6 h、12 h和20 h肺泡巨噬细胞iNOS mRNA的表达水平分别为1.33±0.05、1.44±0.08和1.57±0.11，均高于假手术组(P<0.05)，并不随时间延长而升高；但在术后20 h却低于ghrelin治疗组(2.27±0.37；P<0.05)。Ghrelin治疗组CLP术后20 h肺组织iNOS蛋白表达水平(0.87± 0.03)低于脓毒症组(P<0.05)。Ghrelin治疗组肺组织病理学评分(5.83±0.477)较脓毒症组(7.83±0.75)低，2组均高于假手术组(P<0.05)。结论CLP术后6～20 h，大鼠肺泡巨噬细胞iNOS mRNA的表达水平升高，但无时间依赖性。Ghrelin对脓毒症大鼠肺泡巨噬细胞iNOS mRNA表达起上调作用，而对肺组织iNOS蛋白表达起抑制作用，减轻肺损伤程度。

Ghrelin； 脓毒症； 肺损伤； 一氧化氮合酶； 肺泡巨噬细胞

生长激素释放肽ghrelin是1999年在大鼠体内发现的一种由28个氨基酸组成的内源性的生长激素释放激素受体的配体。人们发现外源性给予ghrelin可使急性肺损伤(acute lung injury, ALI)动物的肺损伤程度和死亡率下降[1-2]，这与ghrelin抑制NF-κB活化的作用有关[2]。NF-κB调控包括诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)在内的多种物质的转录，激活NF-κB可增加iNOS mRNA的表达[3]。Chen等[1]在含肺泡巨噬细胞的培养皿中加入脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和ghrelin后发现，培养液中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性提高。iNOS与ALI的发生发展关系密切。敲除iNOS基因的小鼠在注射LPS后，肺损伤的程度较野生型小鼠显著减轻[4]。此外，肺泡巨噬细胞等炎症细胞内iNOS的活性可影响脓毒症肺部微血管的通透性与氧化应激的程度[5]。这与ghrelin改善肺损伤的作用似乎存在矛盾。另一方面，目前的研究显示ghrelin对iNOS表达的影响不一[6-9]，国内外尚未见ghrelin对ALI肺泡巨噬细胞和肺组织iNOS表达的影响的研究报道。为更好了解ghrelin对脓毒症肺组织iNOS表达的影响，我们建立盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)所致的脓毒症肺损伤大鼠模型，拟通过体内实验观察不同时点肺泡巨噬细胞iNOS的表达水平变化以及外源性给予ghrelin对肺泡巨噬细胞和肺组织iNOS表达的影响，探讨ghrelin对ALI的影响程度，为其应用于临床提供更多的理论依据。

材 料 和 方 法

1动物和实验分组

动物选自中山大学北校区动物实验中心提供的SPF级健康雄性SD大鼠，体重280～330 g，动物使用许可证分别为SCXK(粤)2009-0011和SYXK(粤)2007-0081。将80只大鼠随机分配至10个组，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J组，每组8只大鼠。B、D、F和I组均通过CLP建立脓毒症模型[脓毒症组(CLP组)]，G和J组在建立CLP模型后3 h及15 h给予ghrelin干预[ghrelin治疗组(CLP+ghrelin组)]，A、C、E和H组行假手术[假手术组(sham)]。A和B组及C和D组分别在术后6 h及12 h行支气管肺泡灌洗，E、F和G组则在术后20 h行支气管肺泡灌洗。H、I和J组各组均于术后20 h处死大鼠，采集右上肺叶存于-80 ℃备用，右下肺叶置于10%中性甲醛固定液中。

2脓毒症模型制作

采用CLP制作脓毒症模型，术前不禁食、水。实验过程中动物处置方法符合动物伦理学标准。1%戊巴比妥 50 mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒，沿腹正中线作2 cm切口，距回盲瓣0.5 cm的部位予3/0缝合线环形结扎盲肠，用18号注射器针头贯通穿刺盲肠2次，轻轻挤压肠管使肠道内容物自穿刺孔溢出，原位回纳盲肠，逐层缝合关腹。术后立即皮下注射无菌生理盐水30 mL/kg，以补充术中体液丢失及抗休克。假手术组则在找到盲肠后，将其外置于腹外2 min后按原位回纳腹腔，余步骤同手术组。

3药物干预

G组及J组于术后3 h及15 h腹腔内注射ghrelin(Enzo产品)。按文献资料[2,10]，注射药物总剂量为40 nmol/kg，按时点每次给予20 nmol/kg，溶解于1 mL生理盐水后注射；其余各组注射1 mL生理盐水作为对照。

4标本采集

4.1支气管肺泡灌洗及肺泡巨噬细胞的收集与纯化 参照文献[1]方法提取及纯化肺泡巨噬细胞。按既定时间将大鼠的气管切开插入气管导管，分3次经导管缓慢注入无菌生理盐水，共15 mL，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收率大约85%～90%。将BALF离心(4 ℃、800 r/min)10 min，弃上清，无菌PBS液洗涤细胞沉淀物2次，加入含10%胎牛血清的完全DMEM培养液制成细胞悬液，台盼蓝染色判断细胞存活率>90%。调整细胞数为2×109/L后种板(35 mm细胞培养皿)，于5% CO2、37 ℃培养箱中孵育2 h后，获得贴壁的纯化肺泡巨噬细胞。经瑞氏-姬姆萨染色鉴定该方法获得的贴壁肺泡巨噬细胞纯度>90%。

4.2肺泡巨噬细胞iNOS mRNA的检测 按Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，按RT试剂盒合成cDNA，PCR扩增：PCR引物由上海生工生物公司合成，iNOS上游引物5′-CCT GGA GGT TCT AGA TGA GAG T-3′,下游引物5′-CTT CAG GTT ATT GAT CCA AGT G-3′；iNOS扩增片段为451 bp。β-actin上游引物5′-CCA TTG AAC ACG GCA TTG-3′,下游引物5′-TAC GAC CAG AGG CAT ACA-3′。β-actin扩增片段为234 bp。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃补平5 min，内参照基因28个循环，目的基因38个循环。2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外线灯下观察拍照，用Gel-Pro Analyzer图像分析软件进行半定量分析，以iNOS/β-actin比值表示iNOS mRNA表达的相对水平。

4.3Western blotting测定肺组织iNOS 研磨、裂解右上肺叶提取组织总蛋白，取20 μg变性后蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭，I抗(Abcam公司的抗iNOS多克隆抗体1∶500或β-actin单克隆抗体1∶1 000)4 ℃孵育过夜，兔II抗(1∶2 000)(广州昂科公司)室温孵育1 h，洗膜；应用增强的化学放射发光法(ECL)标记结合信号，X线曝光，以上操作每一样品重复2次。采用Quantity One软件进行图像分析，以iNOS蛋白条带吸光度值与对应β-actin蛋白条带吸光度值间的比值对iNOS蛋白表达量进行半定量分析。

4.4肺组织病理检查 右下肺叶组织予10%中性甲醛固定48 h后，脱水石蜡包埋制备石蜡切片，经透明、水化后，予苏木素、伊红染色，最后中性树胶封片。光学显微镜下观察支气管黏膜、黏膜下、肺组织形态和炎症细胞浸润情况，于×200镜下随机选择视野进行观察，拍照，参照文献[11]方法进行各项评分：分别对毛细血管内红细胞、肺泡腔纤维蛋白及中性粒细胞渗出、气道黏膜上皮细胞脱落以及肺泡间隔情况评分后计算各项的总分。

4.5CLP术后20 h的死亡率 观察H、I和J 3组大鼠在CLP术后20 h内的死亡情况，并统计死亡率。

5统计学处理

统计分析用SPSS 13.0 for Windows 软件处理，各组数据以均数±标准误(mean±SEM表示)，方差齐者，采用方差分析进行分析；各组间多重比较采用LSD法进行分析，分类资料采用卡方检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1脓毒症模型检验

于术后10 h随机抽取模型组大鼠进行血培养，可见大肠埃希氏菌，本实验成功复制了大鼠脓毒症模型。

2肺泡巨噬细胞活力和纯度的测定

台盼蓝染色后，倒置显微镜下计数100个细胞。镜下巨噬细胞大部分呈圆形，折光性强。活细胞不着色，死细胞蓝染，活细胞占计数细胞的百分比表示细胞活力，经检测肺泡巨噬细胞活力均>90%，见图1A。高倍镜下观察瑞氏-吉姆萨染色后的细胞形态，见图1B，可见肺泡巨噬细胞细胞大小不一，核大蓝染，呈肾形或椭圆形，多偏一侧；胞质呈灰蓝色，部分胞质内可见吞噬颗粒，如白色箭头所示。计数100个细胞，肺泡巨噬细胞的百分比表示细胞纯度，本实验方法所得肺泡巨噬细胞纯度均>90%。

Figure 1. Alveolar macrophages. A: trypan blue staining; B: Wright-Giemsa staining.

图1肺泡巨噬细胞

3肺泡巨噬细胞iNOSmRNA表达

经紫外分光光度仪测定所提取RNA的A260/A280在1.8～2.0；经1%琼脂糖凝胶电泳，可见各处理组总RNA 28S和18S区带，且28S区带亮度约为18S的2倍。

与假手术组比较，在6、12和20 h，脓毒症组iNOS mRNA显著升高(P<0.05，P<0.05，P<0.01)；术后20 h，ghrelin治疗组较假手术组(P<0.01)及脓毒症组(P<0.05)升高。然而在20 h内，脓毒症组各时点之间的iNOS mRNA的表达无显著差异，见图2、表1。

Figure 2. RT-PCR analysis of iNOS mRNA expression in alveolar macrophages from each group. A, C, E: sham group; B, D, F: CLP group; G: CLP+ghrelin group.

图2各组iNOSDNA琼脂糖电泳条带

表1肺泡巨噬细胞iNOSmRNA的表达水平

Table 1. The level of iNOS mRNA in alveolar macrophages(mean±SEM.n=8)

Group6h12h20hSham0．74±0．140．68±0．180．63±0．19CLP1．33±0．05#1．44±0．08#1．57±0．11#GLP+ghrelin//2．27±0．37#∗

#P<0.05vssham；*P<0.05vsCLP.

4Ghrelin对CLP大鼠肺组织iNOS蛋白表达水平的影响

术后20 h，脓毒症组(I组)与ghrelin治疗组(J组)肺组织iNOS蛋白的表达水平较假手术组(H组)升高，差异有统计学意义(均P<0.01)；ghrelin治疗组较脓毒症组稍有降低，差异有统计学意义(P<0.01),见图3、表2。

Figure 3. The expression of pulmonary iNOS protein in each group detected by Western blotting assay.

图3各组大鼠肺组织iNOS蛋白的表达水平

5病理学HE染色

在大体肺组织中，可见脓毒症组大鼠的肺组织肿胀，个别大鼠胸腔内有少量血性积液；假手术组肺组织表面光洁，呈粉红色，未见出血点，无胸腔积液。Ghrelin治疗组的肺组织肿胀，少许胸腔积液。在光学显微镜下可见，假手术组肺组织结构完整，气道上皮细胞排列整齐，间质无水肿，个别标本可见小灶性炎症细胞渗出，无出血，肺泡腔无水肿液、无透明膜(图4A)。而脓毒症组(图4B)部分肺泡结构受到破坏，部分上皮细胞变形脱落，肺泡间质和肺泡腔有大量炎症细胞浸润，间质水肿明显，部分有出血，有一例大鼠可见血管内微血栓形成，部分肺泡腔可见少许水肿液，具有ALI的病理改变。与假手术组比较，脓毒症组、ghrelin治疗组肺病理评分增加，有显著差异，均P<0.01。而ghrelin治疗组(图4C)与脓毒症组比较，肺组织病理损伤程度有所减轻(P<0.05)。各组病理学改变评分见表2。

6CLP术后20h大鼠的死亡率

CLP术后20 h，假手术组(H)大鼠无死亡(0/25)，脓毒症组(J)和ghrelin治疗组(J)的死亡率分别为68%(17/25)和45%(14/25)，2组间比较无显著差异(P>0.05)。

Figure 4. Histopathological changes of the right lower lobe of lung (HE staining,×200) A: sham; B: CLP; C:CLP+ghrelin.

图4右下肺组织HE染色

表2肺iNOS蛋白表达及肺组织病理学评分

Table 2. The expression of pulmonary iNOS protein and pulmonary histopathological score (mean±SEM.n=8)

GroupiNOSHistopathologicalscoreSham0．53±0．033．00±0．36CLP1．08±0．05#7．83±0．75#CLP+ghrelin0．87±0．03#∗5．83±0．477#∗

#P<0.05vssham；*P<0.05vsCLP.

讨 论

脓毒症是肺损伤最常见的病因[12]，CLP模型则一直被认为是脓毒症的“金标准”模型[13]。经血流动力学监测，大鼠CLP术后5 h与20 h分别出现高动力循环与低动力循环表现，这2个时点分别被认为是脓毒症的早期和晚期阶段[14]。因此,实验中我们主要观察CLP术后6～20 h的大鼠肺内iNOS表达水平的变化。

肺内多种细胞，如肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞可表达iNOS[15]，后者在炎症病理状态下表达增加，并参与一系列病理生理的发生、发展。虽然肺泡巨噬细胞占肺泡灌洗液细胞总数95%，但在重症感染下，却以中性粒细胞为主，占90%以上[16]。本实验中可获得的肺泡巨噬细胞数目较少，因此本研究通过RT-PCR方法检测肺泡巨噬细胞iNOS mRNA的表达，结果显示CLP术后6 h大鼠肺泡巨噬细胞iNOS mRNA的表达水平已升高，提示炎症感染刺激肺泡巨噬细胞活化，iNOS表达增加。然而随着时间推移，脓毒症组肺泡巨噬细胞iNOS mRNA的表达水平在术后6～20 h内并没有明显变化。我们认为可能与细胞凋亡数目增加以致肺泡巨噬细胞 iNOS mRNA表达的总体水平不再上升有关。有文献报道，CLP术后9 h和20 h大鼠肺泡巨噬细胞的凋亡数目比假手术组分别增加2.5倍和3.2倍[17]。我们在大鼠CLP术后3 h给予外源性ghrelin，观察到术后20 h ghrelin治疗组大鼠肺泡巨噬细胞iNOS mRNA的表达水平较脓毒症组增高，提示ghrelin上调肺泡巨噬细胞 iNOS mRNA的表达。Chen等[1]则在孵育有原代肺泡巨噬细胞的培养基中同时加入LPS和ghrelin后也发现，培养上清液NOS活性较非ghrelin干预组增高。对于我们的研究结果与设想不一致，我们认为ghrelin除通过调控NF-κB抑制炎症因子产生外，还可能通过某些机制抑制肺泡巨噬细胞的凋亡。目前有研究发现ghrelin可以减轻小鼠严重缺血肌皮组织细胞及糖尿病大鼠垂体泌乳细胞凋亡[7, 18]。Sudar等[9]对大鼠采用脑室内注射ghrelin后发现，大鼠心脏iNOS mRNA和蛋白表达上调，磷酸化Akt和ERK1/2增加，认为ghrelin通过Akt和ERK1/2信号通路途径调控iNOS的表达。ERK及Akt信号通路可通过对抗凋亡蛋白或促凋亡蛋白的磷酸化作用参与抑制细胞凋亡的作用[19-20]。但凋亡是否在此起到作用，仍需进一步行相关实验证实。

另一方面，我们发现ghrelin减弱脓毒症急性肺损伤肺部iNOS蛋白表达，这可能是ghrelin对肺内不同细胞iNOS蛋白表达的影响不一所致。肺内多种细胞可以表达iNOS[15]，现有资料显示ghrelin对iNOS既有上调也有抑制作用，提示ghrelin对不同细胞所产生的作用可能不同。譬如Minici等[6]的实验结果显示ghrelin有下调人血管内皮细胞iNOS的作用。肺组织病理结果显示ghrelin治疗组的肺损伤程度较脓毒症组减轻，提示ghrelin有减轻肺损伤的作用，这可能与肺部iNOS的表达下调有关。此外，研究还发现ghrelin治疗组与脓毒症组在CLP术后20 h内的死亡率无明显差异，但我们认为这与盲肠穿孔的病因未去除有关，日后的研究需要结合感染菌的毒力和菌负荷情况进一步分析。

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EffectofghrelinoniNOSexpressioninalveolarmacrophagesandlungtissuesinratswithsepsis-associatedlunginjury

HE Wan-mei, ZENG Mian, YI Hui, JIANG Yu-jie, CHANG Min-chan

(MedicalIntensiveCareUnit,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zengmian2004@163.com)

AIM: To investigate the effect of ghrelin on inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in alveolar macrophages and lung tissues in sepsis-induced acute lung injury (ALI) rats.METHODSThe septic rat model was established by cecal ligation and puncture (CLP). Male SD rats were divided into sham group, CLP group and CLP+ghrelin group. The rats in the former 2 groups were further divided into 3 subgroups, which were 6 h, 12 h and 20 h post-operation groups. Ghrelin was administered by intraperitoneal injection at 3 h and 15 h after operation in ghrelin group. The samples were harvested 20 h after operation. The mRNA expression of iNOS in alveolar macrophages collected from bronchoalveolar lavage was detected by RT-PCR. The protein levels of lung iNOS were measured by Western blotting. The lung pathological examination was performed 20 h after operation.RESULTSIn CLP group, the mRNA expression levels of iNOS in the alveolar macrophages were 1.33±0.05, 1.44±0.08, 1.57±0.11 at 6 h, 12 h and 20 h after CLP, respectively, which were higher than that in sham group, but did not show time correlation. However, it was lower in CLP group than that in CLP+ghrelin group at 20 h after CLP (2.27±0.37,P<0.05). At 20 h after CLP, the protein level of lung iNOS was decreased in CLP+ghrelin group (0.87± 0.03) as compared with CLP group (1.08±0.05). Compared with sham group, the histopathological score was increased in both CLP group and CLP+ghrelin group, but it was lower in CLP+ghrelin group (5.83±0.477) than that in CLP group (7.83±0.75).CONCLUSIONGhrelin treatment improves the degree of ALI. During 6 h to 20 h after CLP, the mRNA expression of iNOS in alveolar macrophages was elevated, but the difference was not seen as the time went on. Ghrelin up-regulates the mRNA expression of iNOS in alveolar macrophages and inhibits iNOS expression in lungs of septic rats.

Ghrelin; Sepsis; Lung injury; Nitric oxide synthase; Alveolar macrophages

R515.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.022

1000- 4718(2013)05- 0895- 05

2012- 12- 30

2013- 04- 28

广东省科技计划(No.2008B030301057)

△通讯作者 Tel： 020-87755766； E-mail: zengmian2004@163.com