黄芪注射液抑制脑缺血再灌注大鼠海马组织Apaf-1表达*

刘 瑞， 高维娟， 钱 涛， 王 利

(1承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000； 2河北化工医药职业技术学院，河北 石家庄 050026)

黄芪注射液抑制脑缺血再灌注大鼠海马组织Apaf-1表达*

刘 瑞1， 高维娟2△， 钱 涛1， 王 利1

(1承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；2河北化工医药职业技术学院，河北 石家庄 050026)

目的观察黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)蛋白及其mRNA表达的影响。方法将健康雄性SD大鼠120只随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、黄芪注射液干预组和溶剂对照组。采用四血管阻断法制备大鼠脑缺血再灌注模型，除假手术组外其余3组根据再灌注不同时点再分为0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h 7个亚组，于再灌注相应时点提取脑组织。采用免疫组织化学和Western blotting检测大鼠海马组织Apaf-1蛋白的表达，RT-PCR法检测Apaf-1 mRNA的表达。结果除0 h和120 h外，脑缺血再灌注组各个时点Apaf-1蛋白及mRNA表达均较假手术组增加 (P<0.05)；与脑缺血再灌注组相比，黄芪注射液干预组各个时点Apaf-1蛋白及mRNA表达均显著减少 (P<0.05)，而溶剂对照组各时点与脑缺血再灌注组相比则均无显著变化 (P>0.05)。结论黄芪注射液能抑制大鼠海马组织Apaf-1蛋白及mRNA表达，从而抑制脑缺血再灌注大鼠海马神经元的凋亡。

脑缺血再灌注； 黄芪注射液； 凋亡蛋白酶激活因子 1； 海马； 细胞凋亡

缺血性脑血管病包括短暂性脑缺血发作、脑血栓形成和脑栓塞，其发病率、死亡率及致残率均高，约占全部脑血管病的70%，而且发病率呈逐年上升趋势，因此，积极、及时、有效地防治尤为重要[1]。临床上常规的治疗主要是溶栓、抗凝、降纤、抗血小板聚集、减轻脑水肿等，其目的是使缺血区的血流再通，但同时再灌注后又可加重脑组织损伤，研究发现这种损伤以细胞凋亡为主。目前，中药在疾病的治疗作用中发挥重要的作用，黄芪注射液为临床治疗缺血性脑血管病的常用药物，可改善微循环、增强心肌收缩力、保护红细胞变形能力和降低血小板黏滞度等，改善缺血性脑血管性疾病患者的症状[2]。本研究前期实验结果表明：黄芪注射液可抑制脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡[3], 且初步证实黄芪注射液可提高Bcl-2/Bax比值，抑制细胞色素C (cytochrome C, Cyt-C) 活性，从而抑制c-Jun 氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK) 通路的活性发挥抗凋亡作用[4]。凋亡蛋白酶激活因子 1(apoptotic protease-activating factor 1，Apaf-1)是JNK通路中线粒体途径下游的关键因子与神经元凋亡密切相关[5]。它被认为是凋亡体的核心，在激活下游caspase级联反应中起着关卡作用。本实验通过观察黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织Apaf-1蛋白及其mRNA表达的影响，旨在进一步阐明黄芪注射液抗神经元凋亡的作用机制。

材 料 和 方 法

1动物

健康雄性SD大鼠120只，体重250～300 g ,鼠龄2～3月，SPF级，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号为SCXK(京)2009-0004。

2试剂和仪器

小鼠抗大鼠Apaf-1单克隆抗体购于Santa Cruz；小鼠抗大鼠β-actin购自Santa Cruz；免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥公司；HRP-DAB底物显色试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；Apaf-1引物是由Invitrogen(上海)贸易有限公司设计合成；TRIzol购自Invitrogen(上海)贸易有限公司，批号为15596-018；RT-PCR试剂盒购自大连宝生物有限公司；黄芪注射液购自成都地奥九泓制药厂，生产批号为国药准字z51021776，10 mL/支；其它试剂为国产分析纯。主要仪器：WH-A300W型高频电刀由北京市朝阳维思通工程电器厂生产；石蜡包埋机和切片机由Leica生产；光学显微镜和显微照相仪由Olympus生产；TDL-40B离心机由上海安亭科学仪器制造厂生产；DYY-6B型稳压稳流电泳仪购自北京六一仪器厂；MK3型酶标仪购自上海雷勃公司；RT-PCR仪 (PTC-100) 购自MJ Research。

3模型制备

采用改良的Pulsinelli 四血管阻断法制作大鼠全脑缺血再灌注模型：大鼠于术前12 h禁食，4 h禁水，4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，将其俯卧位固定，于背侧颈正中纵切口约1.5 cm，钝性分离两旁肌肉，暴露双侧第1颈椎横突翼状孔，用直径0.5 mm电凝针烧灼其中的椎动脉，使其永久性闭塞，逐层缝合切口。然后将大鼠仰卧位固定，行腹侧颈正中切口约1 cm，钝性分离双侧颈总动脉并以“4”号线穿线备用，缝合切口。术后24 h，用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉，30 min后松开微型动脉夹恢复脑血液灌流，造成全脑缺血再灌注损伤。大鼠出现翻正反射消失和双侧瞳孔散大是模型成功的标准，且再灌注期间出现全身僵直、抽搐等异常反应或死亡者除外。假手术组只做皮肤切口和组织分离。

4实验分组及给药方法

造模成功后随机将大鼠分为4组：假手术组、模型组、黄芪注射液干预组和溶剂对照组，除假手术组外其余各组根据再灌注后不同时点又分为0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h 7 个亚组。 黄芪注射液干预组术前30 min腹腔注射黄芪注射液6 mL/kg，且每24 h追加给药1次直到取材[6]。溶剂对照组则给予等量的无菌去离子水。

5免疫组化法检测海马组织Apaf-1的表达

每组于再灌注的相应时点4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，用生理盐水300 mL和4%多聚甲醛400 mL先后行心脏灌注固定，取脑组织，截取视交叉后至大脑横裂的部分，常规脱水石蜡包埋，连续冠状切片，片厚5 μm。 每只大鼠随机选取3张海马组织切片，采用SP法检测Apaf-1的表达，具体操作依据试剂盒说明书进行。小鼠抗大鼠Apaf-1单克隆抗体按1∶50稀释；PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，使用Image-Pro Plus 6.0软件对结果进行分析。

6Westernblotting法检测海马组织Apaf-1蛋白的表达

从-80 ℃冰箱取出海马组织并称重，提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，取80 μg蛋白样品，以8%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白用半干电转移法转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，Ⅰ抗(1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，Ⅱ抗(1∶5 000稀释)室温摇床孵育1 h，TBST洗膜后，采用ECL化学发光法显色，目的条带为130 kD。以β-actin为内参照，实验重复5次。用凝胶分析软件Quantity One分析目的蛋白条带的吸光度值，以目的条带与内参照吸光度的比值表示待测蛋白含量，并将假手术组的比值作为100%对其它组进行校正。

7RT-PCR法检测海马组织Apaf-1mRNA的表达

从-80 ℃取出海马组织，用TRIzol一步法提取RNA，RNA定量后按TaKaRa RNA PCR kit(AMV)说明书进行逆转录为cDNA。内参照β-actin上游引物5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3′，下游引物5′-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3′，扩增片段长度为498 bp。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s，循环30次；最后于10 ℃ 30 min结束。Apaf-1上游引物5′-ACTTGTCGGCCCTGCGCATC-3′，下游引物5′-GGGGCGAACGACTAAGCGGG-3′，扩增片段长度为295 bp。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s，循环33次；最后于10 ℃ 30 min结束。用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。使用凝胶分析软件Quantity One进行定量分析。

8统计学处理

数据以均数±标准差 (mean±SD) 表示，用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析，方差齐者用 LSD-t检验，方差不齐者用 Games-Howell 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织Apaf-1蛋白表达的影响

免疫组化法结果显示，阳性反应为胞浆呈棕黄色。假手术组大鼠海马神经元排列整齐，结构完整，有少量细胞胞质黄染；脑缺血再灌注组大鼠海马神经元排列紊乱，出现核皱缩，大量细胞胞质黄染；黄芪注射液干预组大鼠海马神经元有轻微核皱缩，部分神经元胞质黄染；而黄芪注射液溶剂干预组与脑缺血再灌注组的海马神经元表现一致。除 0 h和120 h 外，与假手术组相比，脑缺血再灌注组各时点 Apaf-1 蛋白表达平均灰度值均增高(P<0.05)；与脑缺血再灌注组相比，黄芪注射液干预组各时点 Apaf-1 蛋白表达灰度值均降低(P<0.05)，而溶剂对照组则无明显差异(P>0.05)，见图1。

Figure 1. The expression of Apaf-1 determined by immunohistochemical staining (SP，×400).A:sham operation group;B:cerebral ischemia-reperfusion group;C:cerebral ischemia-reperfusion+vehicle group;D:cerebral ischemia-reperfusion+Astragalusinjection group.Mean±SD.n=6.#P<0.05vssham operation group;*P<0.05vscerebral ischemia-reperfusion group.

图1免疫组化法检测Apaf-1蛋白的表达

Western blotting结果显示，除 0 h和120 h 外，脑缺血再灌注组各时点 Apaf-1 蛋白平均灰度值均较假手术组增高(P<0.05)；与脑缺血再灌注组相比，黄芪注射液干预组的其余各时点 Apaf-1 蛋白灰度值均明显降低(P<0.05)，而溶剂对照组各时点 Apaf-1 蛋白灰度值无显著差异(P>0.05)，见图2。

Figure 2. Apaf-1 protein expression determined by Western blotting.Mean±SD.n=6.#P<0.05vssham operation group;*P<0.05vscerebral ischemia-reperfusion group.

图2Westernblotting法检测Apaf-1蛋白的表达

2黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马组织Apaf-1mRNA表达的影响

RT-PCR 结果显示，各组 Apaf-1 mRNA表达变化同Apaf-1 蛋白表达趋势相一致，见图3。

讨 论

缺血性脑血管病是临床常见病，在常规治疗过程中会造成脑组织再灌注损伤，研究发现细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的一种重要方式[7]，细胞凋亡是由外界刺激信号转导到细胞内部导致的一系列酶促级联反应，参与细胞凋亡的信号转导通路很多，其中JNK 信号通路的激活与神经元的凋亡密切相关[8]。Apaf-1 是一种抑癌蛋白，参与形成凋亡复合体，是此信号通路中的关键因子[9-11]。Apaf-1存在于细胞质中， 是一种分子量为130 kD的蛋白质，含有3部分特殊的结构域：其氨基末端含有1个半胱氨酸蛋白酶募集域(caspase recruitment domain，CARD)，可结合同源性的 caspase-9；CED-4 同源域含损伤的分子机制之一。320个氨基酸残基，其中包含1个保守的 P 环，与 dATP/ATP 结合，可促进其自身多聚化；羧基末端由12个WD-40重复片段组成，可阻碍其自身多聚化，在各种细胞刺激条件下，它与从线粒体内膜间隙释放到胞质的 Cyt-C结合并使其构象发生改变，消除了对自身多聚化的阻碍作用，导致Apaf-1 激活并可结合 procaspase-9启动活化过程，这三者共同组成凋亡复合体，procaspase-9 同源活化为caspase-9 ，后续进一步激活细胞凋亡的最终执行者caspase-3、-6、-7等使细胞走向不可逆凋亡。

Figure 3. The expression of Apaf-1 mRNA determined by RT-PCR. A: sham operation group; B: cerebral ischemia-reperfusion group; C: cerebral ischemia-reperfusion+vehicle group; D: cerebral ischemia-reperfusion+Astragalusinjection group.Mean±SD.n=6.#P<0.05vssham operation group;*P<0.05vscerebral ischemia-reperfusion group.

图3RT-PCR法检测Apaf-1mRNA的表达

黄芪注射液为中药黄芪提取制成的针剂，具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿等功效[12]，是临床上常用的治疗心脑血管病的药物，疗效可观，但其具体作用机制尚待研究。现代药理学研究表明，黄芪具有扩张血管、清除氧自由基、降低血脂、改善脑血流量、提高超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶和一氧化氮含量、增加微循环灌注等多重作用。

本实验结果显示：大鼠脑缺血再灌注0 h，各组 Apaf-1 蛋白和 mRNA 的表达无明显差异，说明在脑缺血再灌注 0 h 时引发细胞凋亡的 JNK 信号通路尚未发生显著变化，脑缺血再灌注 0.5 h Apaf-1 表达开始升高，并且随着再灌注时间的延长，脑缺血再灌注组 Apaf-1 蛋白和 mRNA 表达进一步升高，于再灌注 6 h达到高峰，再灌注 24 h、72 h 下降但仍高于假手术组，再灌注 120 h Apaf-1 蛋白和 mRNA 的表达降至正常水平，说明 Apaf-1 的过度激活与脑缺血再灌注导致的神经元凋亡有密切的关系，而黄芪注射液可显著降低脑缺血再灌注后除 0 h、120 h 外各时点 Apaf-1 蛋白及 mRNA 的表达，表明黄芪注射液可通过抑制脑缺血再灌注大鼠海马组织 Apaf-1 的表达，从而抑制 JNK 信号通路活性来发挥抗凋亡的作用，这是其抑制脑缺血再灌注

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AstragalusinjectioninhibitsexpressionofApaf-1inrathippocampusaftercerebralischemiaandreperfusion

LIU Rui1, GAO Wei-juan2, QIAN Tao1, WANG Li1

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiChemical&PharmaceuticalCollege,Shijiazhuang050026,China.E-mail:gwj6088@163.com)

AIM: To investigate the effect ofAstragalusinjection on the expression of apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1) in the hippocampus of global cerebral ische-mia-reperfusion rats.METHODSMale SD rats were randomly divided into 4 groups with 30 each: sham operation group, cerebral ischemia-reperfusion group, cerebral ischemia-reperfusion+Astragalusinjection group, and cerebral ischemia-reperfusion+vehicle group. The global cerebral ischemia-reperfusion model of the rats was established by 4-vessel occlusion. The rats in cerebral ischemia-reperfusion group, cerebral ischemia-reperfusion+Astragalusinjection group and cerebral ischemia-reperfusion+vehicle group were further divided into 7 subsets, according to the reperfusion time of 0 h, 0.5 h, 2 h, 6 h, 24 h, 72 h and 120 h. After reperfusion, the brains were removed at the corresponding time points. The protein expression of Apaf-1 in hippocampal neurons was detected by immunohistochemistry and Western blotting. The mRNA expression of Apaf-1 was observed by RT-PCR.RESULTSCompared with sham operation group, the expression of Apaf-1 at mRNA and protein levels at all time points except 0 h and 120 h increased obviously in cerebral ischemia-reperfusion group (P<0.05). Compared with cerebral ischemia-reperfusion group, the expression of Apaf-1 at mRNA and protein levels at all time points except 0 h and 120 h decreased obviously in cerebral ischemia-reperfusion+Astragalusinjection group (P<0.05). However, those in cerebral ischemia-reperfusion+vehicle group had no obvious change (P>0.05).CONCLUSIONAstragalusinjection inhibits the expression of Apaf-1 at mRNA and protein levels in hippocampus of global cerebral ischemia-reperfusion rats, thus inhibiting the apoptosis of hippocampal neurons.

Brain ischemia-reperfusion;Astragalusinjection; Apoptotic protease-activating factor 1; Hippocampus; Apoptosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.018

1000- 4718(2013)05- 0872- 06

2012- 12- 15

2013- 04- 02

国家自然科学基金资助项目(No.81072923)

△通讯作者 Tel: 0311-85110168; E-mail: gwj6088@163.com