分子印迹固相萃取技术在天然产物有效成分分离分析中的应用进展

陈方方， 师彦平

(1.中国科学院兰州化学物理研究所，中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州 730000;2.中国科学院大学，北京 100049）

分子印迹，又称为分子烙印，是源于高分子化学、材料化学、生物化学等学科的一门交叉学科技术。目前，包括瑞典、日本、德国、美国、澳大利亚、法国和中国在内的几十个国家、上百个学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物(molecularly imprinting polymers，MIPs）的研究和开发。MIPs材料具有良好的亲和性和专一的选择性，耐受高温、高压、酸碱和有机溶剂，制备简便易于保存，因此在固相萃取、色谱分离分析、膜分离、模拟酶、仿生传感器等方面得到了广泛的应用［1－5］。自从 Sellergren研究小组［1］于1994年首次报道将MIPs材料作为SPE吸附剂以来，分子印迹固相萃取(molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）方法在国内外逐渐得到广泛的研究和应用。近年来，MISPE技术在天然药物资源活性成分分离方面的应用受到越来越多的关注。本文主要概述了MIPs制备的选择因素以及MISPE技术在天然产物有效成分的萃取与分离分析中的应用进展。

1 分子印迹聚合物制备的选择因素

MIPs的制备一般包括3个过程［6］:首先，将模板分子与功能单体在适当的溶剂中通过一定的作用相互结合形成单体-模板分子复合物;然后加入交联剂在(热或光）引发剂引发下，功能单体与交联剂共聚，将复合物包裹在聚合物的立体结构中;最后将聚合物中的模板分子洗脱除去，便可得到具有与模板分子形状和功能基团排列相匹配的空穴。因此MIPs对模板分子有“记忆”功能，对其有高度的选择性。MIPs的选择性很大程度上与功能单体、交联剂以及溶剂的正确选择有关。

1.1 功能单体的选择

功能单体的选择对得到高亲和力的MIPs非常重要，它决定了MIPs与目标分析物相互作用的稳定性和选择性识别能力。在共价键MIPs中功能单体应该具有能与模板分子发生共价结合的基团。同时，模板分子与功能单体之间的共价键应该容易通过适当的方法断裂。非共价键印迹中，以丙烯酸、甲基丙烯酸酯以及酰胺等为最常用的单体(见表1）。

表1 常用功能单体Table 1 Common functional monomers

在这些已经商用的功能单体中，甲基丙烯酸(MAA）应用较为广泛。其结构中除了一个C=C双键外，还有一个－COOH基团，既可以作为氢键的供体，也可以作为氢键的受体使用［7］。因此，当模板分子中含有氨基、脂肪醇、脂肪胺等基团时，甲基丙烯酸是非常适用的功能单体。具有双键结构的酰胺类和吡啶类单体也是性能优异的选择对象，当模板分子含有羧酸或含有氨基、酰胺基时，利用丙烯酰胺(AM）作为功能单体可以提高 MIPs的选择性［8－12］。此外AM在极性溶剂中也具有较强的氢键作用，这是许多功能单体所不具备的特点。根据模板分子的结构，选择与模板分子具有多作用位点的功能单体，可使MIPs的选择性大大提高。此外，也有报道采用两种或两种以上混合功能单体，可以得到识别性能更强的 MIPs。Mosbach等［13］分别采用2-乙烯基吡啶-甲基丙烯酸和2-乙烯基吡啶-甲基丙烯酰胺作为混合功能单体合成氨基酸衍生物MIPs，证明两种不同性质功能单体的组合可以增加与模板分子相互作用的位点，比用二者中的单一功能单体获得更好的MIPs选择性。

1.2 交联剂的选择

由于要兼顾交联剂和功能单体在溶剂中的溶解性，可应用的交联剂种类不多。在有机溶剂中进行分子印迹实验，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA）以及二乙烯基苯(DVB）是常用的交联剂［14－16］。通过EGDMA合成的聚合物孔穴容易让目标分子接近，迅速达到吸附平衡，同时还能使MIPs保持一定的刚性，在洗去模板分子后，可以保持孔穴的大小和形状以便再结合。二乙烯基苯能够提供较大的交联度从而使制备的MIPs刚性很大，因此也使用得较多。而在水相中常用的典型交联剂则是N，N'-亚甲基双丙烯酰胺。

1.3 溶剂的选择

所选择的溶剂首先应能溶解聚合反应中所需的各种试剂。它的主要作用一是为印迹聚合物提供多孔结构，进而促进目标分子的键合速度;多孔结构的形成对于目标分子的释出也很重要。二是能分散在聚合反应中所释放的热量，否则局部反应温度过高会导致某些副反应的产生。溶剂的选择主要依赖于印迹的种类，在共价键印迹法中，可以溶解体系中所有组分的溶剂都可以使用。而在非共价键印迹中，为促进模板分子和功能单体复合物形成的稳定性，常优先选用弱极性有机溶剂，同时也要考虑溶解性能。常用的溶剂有甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜等。不过近年来，在极性溶剂中的印迹也取得了进展。Mosbach等［17］在甲醇与水混合体系中，以4-乙烯基吡啶(4-VP）为功能单体，成功印迹了除草剂2，4-二氯苯氧基乙酸MIPs。杨宏等［18］在甲醇与甲苯混合溶剂中，以MAA为功能单体，印迹了氯磺隆MIPs，并成功应用于水、土壤等实际样品的检测分析。Makoto 等［19］、Haginaka 等［20］、Yoshida等［21］以及罗旭彪等［22］以水为溶剂进行分子印迹，并取得了良好的结果。这些研究为分子印迹技术接近天然分子识别系统水平奠定了一定基础。

2 MISPE在天然产物萃取中的应用

中药作为重要的天然药物资源之一，化学成分复杂，结构类型多样，尤其是一些活性成分含量较低，难以富集。而且其体系复杂，大分子和小分子共存，生命和非生命物质共存，特别是存在结构相似的化合物，这些都导致中药活性成分的分离纯化困难。目前，用于中药活性成分的分离材料主要有硅胶、氧化铝、大孔吸附树脂和凝胶等。这些传统吸附剂选择性较差，经常需要多次溶剂萃取和柱层析来得到纯度高的活性成分，分离效率和收率较低，而且会造成环境的污染。MISPE技术中以MIPs作为吸附剂，可以选择性识别模板分子及其结构类似物，操作简单，溶剂消耗量小。MISPE对天然产物活性成分的研究主要集中在黄酮类、多元酚类、有机酸、生物碱、苯丙素和萜类等几类化合物。

2.1 黄酮类活性成分的分离纯化

黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，多具有颜色。在植物体内大部分与糖结合成苷，少部分以游离形式存在。黄酮类化合物不仅分布广泛，而且生物活性多样，如抑制特异性关键酶、调节神经递质的释放等，具有降血脂、降胆固醇、保肝抗炎以及雌激素样作用［23］。目前已经以7种黄酮类化合物(槲皮素、芦丁、木犀草素、光甘草定、葛根素、山柰酚和非瑟酮）作为模板分子合成MIPs，进行了 MISPE 技术应用研究。Mizaikoff等［24］、Liu等［25］、Song 等［26］、Turner 等［27］、Xu 等［28］分别以槲皮素为模板分子合成MIPs，并建立了MISPE方法用于萃取葡萄酒、侧柏叶等复杂基质以及血浆中的槲皮素，取得了良好的富集纯化效果。基于MIPs也可以同时吸附结构类似物的特点，Mizaikoff等［29］采用热聚合的方法，以4-VP为功能单体，EGDMA为交联剂，槲皮素为模板分子制备了MIPs。以此为吸附剂所建立的固相萃取方法成功用于富集分离槲皮素以及结构类似的黄酮类化合物。Lopez等［30］采用与Mizaikoff相同的合成方法，以槲皮素为模板分子在丙酮、乙腈混合溶剂体系中制备了MIPs。以此为吸附剂所建立的固相萃取方法不仅对槲皮素模板分子有特异吸附性能，对类似物儿茶酚和没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG）也具有优异的吸附性能，已成功用于富集分离天然产物中的儿茶酚。Xu等［31］以槲皮素为模板分子，AM为功能单体，在四氢呋喃溶剂中合成MIPs，对槲皮素及其结构类似物都有特异吸附性能。应用于固相萃取中，成功地从银杏叶提取物中分离富集到了槲皮素和山柰酚生物活性成分。Pakade等［32］以槲皮素为模板分子合成 MIPs，并建立了MISPE方法用于富集分离辣木叶和花中的槲皮素和山柰酚等黄酮类成分，回收率(75%～86%）结果良好。此外，Wang等［33］以芦丁为模板分子，AM为功能单体，通过微波加热本体聚合制备了MIPs，并用于中药蒌蒿、杜仲、青蒿和三白草中芦丁活性成分的萃取分离，回收率为85%～91%。Theodoridis等［34］以芦丁和槲皮素作为混合模板分子合成MIPs，建立了MISPE方法用于葡萄酒、果汁和茶中黄酮类成分的萃取分离，取得了良好的结果。还有报道分别以非瑟酮［35］、葛根素［36－38］、光甘草定［39］、山柰酚［40］和木犀草素［41］为模板分子，并建立了 MISPE技术用于富集分离中药黄栌、葛根、甘草、高良姜和马齿苋以及花生壳中相应模板分子生物活性成分。

2.2 多元酚类活性成分的分离纯化

目前已有MISPE应用于白藜芦醇、茶多酚、虎杖苷和α-生育酚酚类化合物的研究。白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、花生和虎杖等70多种植物中的天然二苯乙烯类多酚物质，是一种天然的抗氧化剂，可降低血液黏稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生和发展。Zhang等［42］以白藜芦醇为模板分子，AM为功能单体，EGDMA为交联剂，对硅球进行氨丙基三甲氧基硅烷试剂硅烷化处理后通过表面印迹技术在二氧化硅微球表面进行分子印迹过程。合成的MIPs分子印迹层的厚度为150 nm，作为固相萃取吸附剂用于萃取中药虎杖中的白藜芦醇取得了良好的结果。Zhang等［43］用同样的制备过程，对硅球进行乙烯基三甲基硅烷试剂的硅烷化处理后，通过表面印迹方法制备白藜芦醇MIPs，分子印迹层厚度为200 nm。并通过静态平衡结合法以及Scatchard分析法研究了该聚合物的结合能力和选择性能。结果表明，该印迹聚合物中形成了两类不同的结合位点，最大吸附量分别为9.087和13.80 mg/g。将该MIPs作为固相萃取吸附剂用于分离中药虎杖提取液中的白藜芦醇，得到良好的效果。Hearn等［44］以白藜芦醇为模板分子，4-VP为功能单体合成MIPs建立MISPE方法，成功地从花生废渣中分离富集出活性成分白藜芦醇，回收率大于60%。Crescenzi等［45］以白藜芦醇为模板分子合成MIPs并建立固相萃取方法，用于分析检测天然产物以及葡萄酒中的多酚类成分。所合成的材料对白藜芦醇以及槲皮素等结构类似物都有良好的吸附性能，对白藜芦醇和槲皮素在实际样品的检出限低至1.5和7.0 μg/L。Zhong等［46］以EGCG为模板分子，MAA为功能单体，EGDMA为交联剂，在光冷引发条件下合成了EGCG的MIPs，以此为固相萃取吸附剂用于提取茶叶中的茶多酚，回收率达到了69.3%。且制备的MIPs固相萃取柱具有较好的稳定性和耐用性能，使用20次后其选择性识别能力仍未降低，而非印迹柱却没有这样的选择性识别能力。Lehotay等［47，48］以儿茶酚为模板分子合成MIPs并建立MISPE方法成功用于绿茶提取物中茶多酚类化合物的富集分离。Yao等［49］以表儿茶素为模板分子制备了MIPs，粒子大小在15～38 μm范围内，分布范围较窄。对表儿茶素的吸附量达到38 μg/g，可用于固相萃取绿茶提取物中的表儿茶素活性成分。此外，Xiang等［50］以白藜芦醇苷为模板分子，分别以AM、4-VP、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA）、MAA为功能单体，EGDMA为交联剂，采用本体聚合法制备了白藜芦醇苷MIPs。采用静态平衡结合实验研究了印迹聚合物对模板分子及不同底物的识别性能。结果表明，以AM为功能单体的MIP1对模板分子的识别性能最好，以4-VP为功能单体的聚合物其次，以HEMA及以MAA为功能单体的聚合物的分子识别性能较差。表明功能单体与模板分子之间相互作用的强弱对MIP的识别能力有较大的影响。静态平衡结合法以及Scatchard分析法表明，MIP1对模板分子呈现较好的结合能力和选择性，该印迹聚合物中形成了两类不同的结合位点，解离常数分别为7.43×10－5、3.70×10－3mol/L。将MIP1用于虎杖提取物中白藜芦醇苷的固相萃取分离，效果良好。Puoci等［51］以 α-生育酚为模板分子，MAA为功能单体合成MIPs用于固相萃取天然植物中的α-生育酚活性成分，取得良好的结果，检出限和检测量值分别为3.49×10－7和1.16 ×10－6mol/L。

2.3 生物碱类活性成分的分离纯化

一些生物碱因具有抗肿瘤、抗癌、低毒、低成本的特点，最近已成为人们研究的焦点。科学、高效地从植物中提取和分离纯化生物碱成分是扩大其实际应用的核心问题。目前应用MISPE对12种生物碱如长春碱、麻黄碱、黄连素等进行了研究。Lopez等［52］分别以长春碱和文朵灵为模板分子，MAA或亚甲基丁二酸为功能单体，EGDMA为交联剂，在乙腈或丙酮溶剂中通过热聚合的方式合成MIPs用于萃取分离长春花中的吲哚类生物碱活性成分。实验结果表明以长春碱为模板分子制备的MIPs对两种化合物都有较好的特异性吸附能力，对长春碱的回收率达到101%。长春碱 MIPs的最大吸附量为2.43 μmol/g。Dong 等［53］以麻黄碱为模板分子，MAA为功能单体制备麻黄碱MIPs，成功地从麻黄植物提取液中固相萃取分离出麻黄碱活性成分。Chen等［54］以黄连素为模板分子，通过非共价键方法合成黄连素MIPs用于固相萃取，对黄连素具有良好的特异性吸附能力，可以有效地将非洲防己碱与之分离。静态平衡结合法以及Scatchard分析法表明，MIPs对模板分子呈现较好的结合能力和选择性，解离常数为65.8 μmol/L。所建立的方法可成功用于天然产物中黄连素的分离分析。此外，有报道对其他类的生物碱也进行了MISPE研究，如表2所示。

表2 分子印迹固相萃取技术在生物碱类活性成分纯化分离中的应用Table 2 Applications of MISPE in the extraction and separation of the alkaloid active constituents

2.4 有机酸类活性成分的分离纯化

目前已经有一些对绿原酸、原儿茶酸、咖啡酸等化合物进行的MISPE应用研究。绿原酸是酚类抗氧化剂，它不仅能快速地消除羟基自由基，而且能有效地通过电子转移修复脱氧鸟苷酸氧化性羟基加成自由基。除了抗氧化力强外，绿原酸还具有抑制和杀灭多种致病菌和病毒、抗肿瘤、抑制突变、抗致畸、抗过敏、升高白细胞、保肝利胆、降血压等功能［67］。姚守拙等［68］以绿原酸为模板，MAA为功能单体，EGDMA为交联剂，采用沉淀聚合技术在碳纳米管表面成功制备绿原酸印迹材料。吸附动力学及吸附容量实验结果表明，此MIPs对绿原酸的结合存在两个结合位点，最大吸附容量分别为21.5和32.7 μmol/g。此印迹材料作为固相萃取吸附剂，成功应用于金银花提取液中绿原酸的富集分离研究，富集因子达 25。Lehotay 等［69］、Shi等［70］以原儿茶酸为模板分子，分别通过本体聚合和沉淀聚合的方法合成原儿茶酸MIPs并建立固相萃取方法，分别应用于香蜂花和中药千年健中选择性萃取分离原儿茶酸及结构类似酚酸类成分，回收率结果良好。Li等［71］以咖啡酸苯乙基酯为模板分子，4-VP为功能单体制备出MIPs，并以此为固相萃取吸附剂选择性分离富集25种蘑菇中的咖啡酸苯乙基酯和咖啡酸生物活性成分，回收率分别为85%和52.3%。Row等［72］以咖啡酸为模板分子，AM为功能单体制备MIPs，并成功用于固相萃取海蓬子植物中的原儿茶酸、咖啡酸和阿魏酸生物活性成分，回收率为71.08%～81.02%。此外，袁小红等［73］采用柯里拉京为模板分子制备MIPs并用于固相萃取中药叶下珠中的柯里拉京及其结构类似物，能特异性地将柯里拉京及老鹳草素从叶下珠提取液中萃取出来，可用于富集、萃取中药中的柯里拉京及其结构类似物。

2.5 苯丙素类生物活性成分的分离纯化

鬼臼毒素来源于天然产物，因其抗肿瘤活性而引起人们的关注。Yuan等［74］等以鬼臼毒素为模板分子，AM为功能单体，EGDMA和DVB为双交联剂制备出鬼臼毒素MIPs用于固相萃取八角莲、桃儿七和窝儿七中的鬼臼毒素生物活性成分，取得了良好的结果，回收率为89.5%～91.1%。Ding等［75］也以鬼臼毒素为模板分子，采用类似方法合成MIPs。吸附动力学及吸附容量实验结果表明，此MIPs对鬼臼毒素的结合存在两个结合位点，解离常数分别为0.337和5.76 mmol/L。将其应用于固相萃取藏药桃儿七中的鬼臼毒素成分，回收率良好，可以成功地使其与4'-去甲鬼臼毒素分离开来。He等［76］和Ding等［77］分别以秦皮乙素和秦皮甲素为模板分子制备了MIPs，分别用于固相萃取中药秦皮中的秦皮乙素和秦皮甲素，回收率结果良好，对秦皮甲素的回收率可以达到74.7%。

2.6 萜类生物活性成分的分离纯化

奇壬醇是二萜类化合物，近年来研究发现奇壬醇在抗炎、抗风湿以及免疫系统调节方面具有良好的活性，是临床研究治疗抗风湿药物的主要药物之一［78］。目前，奇壬醇的分离纯化主要采用硅胶等传统的吸附剂，分离和纯化工艺复杂，溶剂用量大，环境污染严重;同时由于传统的吸附剂亲和性和选择性差，奇壬醇的分离效率低。Shi等［79］通过非共价键印迹方法首次合成了以奇壬醇为模板分子的MIPs材料。将MIPs填充于固相萃取柱中应用于中药豨莶草提取物中奇壬醇的萃取，所制得的MIP对目标分析物具有良好的选择性和吸附性能，回收率可达80.9%。Cao等［80］以青蒿素为模板分子，MAA为功能单体，EGDMA为交联剂，通过表面印迹在硅胶微球表面形成印迹层，对青蒿素的吸附量为37.13 mg/g，用于固相萃取青蒿中的青蒿素活性成分，取得了良好的结果。Chen等［81］以非共价方法合成了青蒿素MIPs，对青蒿素的吸附量为8.46 mg/g，其吸附量虽然低于表面印迹方法，但也可成功地从青蒿提取液中萃取分离出青蒿素。此外，对其他萜类活性成分也进行了MISPE研究(见表3）。

表3 分子印迹固相萃取技术在萜类活性成分纯化分离中的应用Table 3 Applications of MISPE in the extraction and separation of the terpenoid active constituents

2.7 其他生物活性成分的分离纯化

除上文所述之外，有报道对大黄酸、丹参酮、17β-雌二醇、川芎嗪、藏红花素等化合物也进行了MISPE应用研究。在此，对部分报道中模板分子的选择、目标分子的检测、应用的基质以及回收率进行了总结(见表4）。

表4 分子印迹固相萃取技术在其他类活性成分纯化分离中的应用Table 4 Applications of MISPE in the extraction and separation of other active constituents

3 结论

天然药物体系中的有效成分复杂且含量差异大，对其进行分离纯化是一项非常艰巨的工作。传统分离材料选择性差，分离效率低，容易丢失微量有效成分。如何从复杂的天然药物体系中分离纯化活性成分成为中药开发的关键问题之一。MIPs材料对特定化合物及其类似物具有专一吸附能力，具有其他分离材料所不具备的高选择性，将其应用于固相萃取天然药物中的活性成分，可以提高萃取效率，简化天然药物样品前处理过程，在天然药物活性成分的分离和分析中具有很好的应用前景。但是此项技术在实际应用中还存在一些问题，比如吸附容量不够大，富集倍数不够高，识别能力容易受上样溶剂的影响，在水溶液中的选择性比较差等，还有待于大量研究工作的开展。

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