肽组学样品前处理方法与技术进展

魏黎明， 陆豪杰， 杨芃原， 武 欣

(1.复旦大学生物医学研究院＆化学系，上海 200032;2.复旦大学附属妇产科医院，女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海 200011）

肽组学是研究生物体内源性低分子量蛋白质或多肽(low-molecular weight protein or polypeptides，LMWP）及其变化规律的科学［1］。目前国际上的权威组织(如国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC））对肽组学中LMWP的分子量范围无明确界定，大多数科学家将低于20 kDa的蛋白质或肽确定为肽组学的研究目标，个别科学家也将其上限扩大到50 kDa［2］。被关注的LMWP分为两类，一类是体内自身存在的活性多肽，如激素、细胞因子、神经肽等;另一类是由体内蛋白质经特殊水解酶进行特异性水解的产物，这些产物可以自由通过内皮细胞进入血液循环;LMWP作为参与生命活动中细胞分化、神经激素递质调节、炎症、肿瘤发生和发展、免疫细胞渗透等进程的产物，反映了机体发生病变的代谢水平［3-5］。在临床医学领域，对血液等样本中LMWP的研究可以为临床疾病的早期诊断提供高灵敏、高特异性的分子标志物［6］。同时，针对内源性LMWP的活性酶相关性、后修饰以及与其相互作用蛋白质的更深入研究也将有助于探索疾病的发生、发展、转移机制等。近几年，肽组学的研究获得了迅速的发展，在生物标志物发现、疾病早期诊断、生物制药等领域有着广阔的应用前景。

肽组学研究过程包括样品前处理、分离分析、检测、定性、定量和数据分析，其中样品前处理是整个过程的基础［7，8］。生物标本离开活体后易受外界条件影响，LMWP的真实表达水平将发生不同程度的变化，从而阻碍了肽组学数据向临床领域的转化应用。因此如何在处理样品过程中维持LMWP的稳定就变得越来越重要［9］。此外，在细胞、组织、体液中发挥重要生理功能、具有研究意义和价值的LMWP丰度较低，因此如何在高度复杂、动态范围广的生物体系中获得低丰度的内源性LMWP也是关键的一步。面对上述问题，肽组学样品前处理方法和技术面临着严峻的挑战，这也为研究者发展样品前处理新方法和新技术提供了良好的契机。本文将从标本准备、变性前处理、LMWP提取富集方法三方面进行综述。

1 标本准备

标本从生物机体分离后，机体调控平衡被打破，从而导致蛋白质的种类、含量和修饰快速变化，样本中提取、富集、检测到的部分蛋白质实际上是高丰度蛋白质水解产生的片段，而不是此类蛋白质在标本中的真实表达水平［10］。人类蛋白质组学专业委员会(Human Proteome Organisation，HUPO）在完成人类血浆蛋白质组计划过程中，为排除上述问题专门成立了标本采集和处理委员会(the Specimen Collection and Handing Committee，SCHC）并制定了相关标准。LMWP受水解酶的影响，更易在样本收集、存储、处理过程中发生表达水平的变化。为获得准确、可信的肽组学信息，科研工作者对肽组学的标本准备提供了缜密的实验数据和建议，为肽组学在临床转化医学中的应用奠定了坚实的基础。Di Girolamo等［11］采用C18磁性微球-基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS）联用技术，评价了不同标本准备条件(凝血时间、存储温度和时间、添加蛋白酶抑制剂与否）下血清中LMWP的变化情况，给出标本应尽量在2 h凝血时间、4℃下存储1 h内或-80℃下存储1个月内、无蛋白酶抑制剂加入的情况下完成血清多肽组学分析的建议。Banks等［12］提出在血清多肽组学分析过程中应建立质量控制标准谱峰;血清需要在活化剂处理的采血管中凝血1 h后进行收集、储存或分析;加入抗凝剂的血浆标本应尽量在1 h内完成测试分析，从而保证样本中LMWP的稳定性。Zimmerman等［13］则通过 LC-MS/MS以及多反应监测技术对血清和血浆标本准备过程中多肽以及蛋白质的变化进行了统计学分析，结果表明血浆在4℃保存1周以及反复冻融25次等条件下，血浆中LMWP的稳定性大大高于现有的其他文献推断，从而进一步证实血清和血浆多肽组学向临床医学的转化应用切实可行。在唾液的多肽组学分析过程中，de Jong等［14］发现快速冻存唾液标本可以获得高回收率的肽组学谱，病人的营养状态、标本室温存储15 min内对唾液中的LMWP无明显影响;采用双向荧光差异凝胶电泳以及LC-MS/MS技术，Scholz等［15］首次评价了快速液氮冻存、快速加热失活以及快速液氮冻存后热失活处理肝脏和肾脏组织标本的蛋白质以及对LMWP的降解变化情况，证实在快速液氮冻存标本中出现了大量降解产物。快速液氮冻存方法会破坏细胞膜和细胞结构，使标本融化后降解和修饰蛋白质的酶分布得更广泛，导致更多蛋白质或其修饰形式发生改变，因此快速热失活处理方法相对快速液氮冻存方法更严谨。对于尿、泪液等标本，科研工作者建议低温储存，加入少量蛋白酶抑制剂防止非内源性水解肽的产生，保持标本准备标准统一化，从而真实可信地反映生物体的多肽水平，为后续临床转化应用提供基础保障。

2 标本变性前处理

众所周知，血清中高丰度蛋白质(白蛋白或免疫球蛋白等）对LMWP具有绑定和运输的作用，而且LMWP的丰度低，因此科研工作者采用不同的变性条件对血清进行变性前处理，该过程不仅有效削弱LMWP与高分子量蛋白质(highmolecular weight protein，HMWP）之间的作用力，而且使水解酶的活性降低，从而提高了血清样本中LMWP的回收率，更真实地反映标本中LMWP的表达水平。Zhou等［16］采用免疫共沉淀技术富集血清中6种高丰度蛋白质后，以0.2%(v/v）甲酸或6 mol/L尿素解离与其相互作用的LMWP，并超滤收集、酶解、质谱鉴定，获得了210种蛋白质信息，从而证实变性处理样本对提高LMWP回收率和数目是必要的。Tirumalai等［17］采用5倍体积的25 mmol/L碳酸氢铵/20%乙腈(pH 8.2）进行血清变性，相比5倍体积的25 mmol/L碳酸氢铵稀释液处理血清中LMWP的回收率提高约30%～40%。Kawashima等［18］则采用2倍体积的蛋白质提取液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、20 mmol/L二硫苏糖醇）进行血清变性，结合不同溶解度方法进行 LMWP的提取。Vitorino等［19］则强烈建议收集唾液标本后迅速加入尿素并超声变性，该处理方法对唾液中LMWP回收率的提高及其稳定性更为有利。Good等［20］采用等体积的2 mol/L尿素、10 mmol/L 氨水、0.02%(w/w）十二烷基磺酸钠稀释液对尿液样本进行变性处理并释放与 HMWP作用的 LMWP。Ziganshin等［21］对血清进行98℃加热15 min的变性处理，为获得高回收率、稳定性的血清LMWP数据提供了简单可行的方法。因此，除样本LMWP需要进行免疫实验外，为保证LMWP高的回收率和富集重现性，变性前处理步骤是必要的。然而，部分研究者认为对标本的附加处理将引起LMWP的变化，因此他们直接进行血清中 LMWP的提取分析。如 Fan等［22］利用不同吸附机理的磁珠对大肠癌血清中的LMWP直接进行提取富集。针对不同提取富集方法，变性前处理所用的试剂和方式也不尽相同。

目前对细胞以及组织标本的变性前处理方法有加热、微波照射处理、辅助添加剂提取等。传统细胞或组织标本中LMWP的变性提取方法是在热水中变性后以不同溶解度的提取液进行处理［23］。Bora等［24］采用90℃热水中变性10 min，再以预冷酸性丙酮(丙酮/水/盐酸(40∶6∶1，v/v/v））以及酸溶液(0.25%(v/v）乙酸）顺序提取大鼠下丘脑视上核的LMWP，检测到85条肽，其中发现了20条新的激素源肽。Sturm等［25］采用生物样品稳定仪(Stabilizor T1）变性处理甲壳动物的心包器官组织，并以酸性甲醇、N，N-二甲基甲酰胺为提取液进行LMWP的提取，证实传统方法在甲壳动物肽组学研究中切实可行，并给出了热变性在LMWP提取中的必要性。Svensson等［26］采用聚焦微波辐射(4.5 ～5 kW，1.4 s）处死小鼠，并使脑组织内水解酶失活，取样后快速液氮研磨，以0.25%(v/v）乙酸溶液超声波提取脑组织中的LMWP，在1 mg下丘脑组织中获得了550个内源性神经肽峰，相对于无微波辅助处理的鼠脑样本可以有效降低血红蛋白的降解肽峰［27］，因此聚焦辐射后液氮研磨提取方法可以有效降低水解酶的活性并维持内源性LMWP的后修饰状态;但该方法仪器成本高，处理后的LMWP不能进行免疫检测反应分析。Che等［28］将取样后的鼠脑迅速置于微波炉(1.38 kW）中加热处理8 s后迅速液氮冻存;研磨后的脑组织在70℃热水中超声变性处理20 min，继续加入预冷盐酸溶液(10 mmol/L）提取内源性神经肽，获得了95条神经肽;通过同位素标记评价该方法对鼠脑中LMWP的提取重现性，内源性神经肽变化在25%以内。Romanova等［29］以二羟基苯甲酸(dihydroxybenzoic acid，DHB）为变性提取液，建立了一步处理、提取、储存的肽组学新方法，即以水饱和DHB溶液对组织切片或细胞进行LMWP的提取;采用MALDI-MS(600～4000 Da）分析，在小鼠脑垂体中检测到24条已知内源性神经肽;该方法可以有效抑制超声或加热酸处理过程中蛋白质天冬氨酸-脯氨酸键的断裂(Asp-Pro在酸性条件下易水解断裂）;同时，提取的LMWP在4℃下保存3年后仍然可以获得非常好的质谱检测重现性。但该方法因DHB基质结晶不均匀，在基于MALDI-MS定量分析LMWP中存在一定的局限性。

3 LMWP提取富集前处理方法和技术

内源性LMWP的最大特点是分子量相对较小、丰度低。根据这一特点，研究者发展了不同的前处理方法和技术对血清、脑脊液、尿液、唾液、组织等生物样本中的内源性LMWP进行提取富集，如超滤技术(分子量截留膜）、有机溶剂沉淀方法、固相萃取技术及其他技术等。

3.1 超滤技术

超滤技术是以膜表面的微孔结构为介质，以膜两侧的压力差为驱动力对样品进行选择性分离的膜分离技术。超滤膜只允许溶液中小于特定分子量的分子通过，而大于特定分子量的分子被截留在膜上方，从而达到选择性分离的目的。该技术已经被广泛用于蛋白质组学、糖组学、代谢组学等领域。在3000×g离心条件下，Tirumalai等［17］采用 Centriplus®截流膜(molecular weight cut-off，MWCO，30 kDa）有效排除了HMWP(如白蛋白）的干扰，提取富集了血清中的LMWP，并结合胰蛋白酶水解和LCMS/MS技术鉴定到340种蛋白质。Harper等［30］以50 kDa MWCO截留膜处理100 μL血清，并结合溶液内等电聚焦和LC-MS/MS技术给出了262种LMWP，LMWP的回收率大约在40%～60%。Zheng等［31］采用线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱(LTQ-FT MS）分析了10 kDa MWCO处理后的血清样本，在2 ppm精度下获得了300条特异性肽。针对≤25 kDa的血清多肽，Greening等［32］对4种不同的MWCO膜进行了比较分析，最终建立了在20℃、4000×g下，以Sartorius Vivaspin®截留膜处理100 μL 10%乙腈稀释血清35 min的策略，获得血清中LMWP的回收率约94%。Zougman等［33］将超滤技术用于脑脊液神经肽富集时，充分显示了该技术的优势，在2 mL脑脊液中鉴定得到了563条肽(归属于91种蛋白前体），其多为N-端焦谷氨酸化、C-末端酰胺化并且含有高半胱氨酸，这些数据为脑脊液肽组学的深入研究奠定了基础。此外，不同尺度的MWCO膜(5～50 kDa）也被成功用于唾液、尿液、脑脊液、泪液、组织提取液中LMWP的提取富集［34，35］。超滤技术在LMWP样品前处理中得到了广泛的应用，但该技术仍存在以下缺点有待于解决，如:膜上层浓缩后的大分子堵塞膜孔，导致超滤速度过慢或停滞;超滤膜对LMWP有一定的吸附作用;其他盐类等干扰小分子与LMWP共富集;对大体积样本处理耗时;不同厂家生产的超滤装置重现性和回收率不稳定等现象。

3.2 有机溶剂沉淀法

有机溶剂沉淀法的原理是有机溶剂的加入可以降低水的介电常数，导致溶液中大分子量蛋白质之间疏水作用力下降、静电作用力增强，从而相互聚集，直至析出，而溶液中的LMWP则溶解在有机溶剂中。实验中使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，以及非有机溶剂三氯乙酸、饱和性无机盐等。早在1946年乙醇就被用于血浆中白蛋白的富集沉淀。Alpert等［36］则最早提出用2倍体积的乙腈对血清中高分子量、高丰度蛋白质进行沉淀处理，从而获得小于20 kDa的LMWP;Kay等［37］采用MRM以及凝胶电泳技术对该方法进行了评价，在大于75 kDa范围内无相关蛋白质的检出，并证明该方法有效去除了99.6%的 HMWP。Tucholska 等［38］比较不同有机溶剂时发现，冰丙酮对HMWP的沉淀最完全;甲醇作为沉淀试剂使用时，在LMWP收集液中可以检测到大量的白蛋白，因此不推荐使用。Polson等［39］比较了有机溶剂、酸、盐和金属离子添加剂对HMWP的剔除情况，最终发现乙腈可以获得大于96%的沉淀效率。Chertov等［40］则发展了一种添加离子对试剂三氟乙酸的有机溶剂沉淀新方法，该试剂有利于LMWP从高丰度蛋白质上的解离，同时体系pH值低于蛋白质等电点时更有利于蛋白质与离子试剂的共沉淀。针对样本收集量较低的泪液，Hayakawa等［41］用 3 倍体积的 90%(v/v）甲醇/0.1%(v/v）甲酸溶液进行LMWP的提取富集，在泪液中发现了约30条多肽，为其后续生理作用研究提供了基础。赵龙山等［42］也曾采用3%(v/v）甲酸/乙腈溶液进行大分子量蛋白质的沉淀。Kawashima等［43］根据不同有机溶液的使用，发展了一种不同溶解度沉淀HMWP的新方法(differential solubilization，DS）并且与Chertov等的有机溶剂/离子对试剂沉淀方法、30 kDa MWCO以及高丰度蛋白剔除试剂盒(ProteoExtract白蛋白/IgG）进行了比较，该方法对LMWP获得了更好的回收率和重现性。针对唾液样本分析，Vitorino等［44］将有机溶剂沉淀法与超滤技术进行了比较，经碳酸氢铵/乙腈变性处理样本后超滤的方法对≤10 kDa LMWP的富集能力和鉴定肽数目上更胜一筹。Potier等［45］向血浆样本中加入合成的定量串联体(QconCAT）蛋白质酶解肽段，并结合相对和绝对定量的质量差异标签(mTRAQ）和MRM技术，对C8磁珠固相萃取、5 kDa MWCO超滤法、乙腈有机溶剂沉淀法进行了比较，证实在LMWP的回收率和重现性上，2倍体积的乙腈有机溶剂沉淀法优于其余两种方法。鉴于不同的研究者获得了不同的优化结果，因此在LMWP的样品前处理过程中需要建立标准程序，以便实现良好的重现性。有机溶剂沉淀法用于LWMP提取富集的不足之处在于:对于LMWP的富集无明确的分子量范围;盐类等干扰小分子与LMWP共富集;部分LMWP存在可能共沉淀的现象以及大量有机溶剂的使用稀释了LMWP。但该方法相对于其他方法具有快速、简单、成本低的优势。

3.3 固相萃取技术

固相萃取(solid phase extraction，SPE）是从上世纪80年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术，用于样品的分离、净化和富集。在肽组学应用中，除使用常规的疏水、亲水、离子相互作用的固相萃取柱外，新型萃取富集材料也得到了充分发展，如:表面增强激光解吸离子化(surface-enhanced laser desorption/ionization，SELDI）芯片、磁性富集材料、纳米材料、限进材料等。

3.3.1 SELDI芯片

SELDI芯片，即芯片表面经化学(阳离子、阴离子、疏水、亲水和金属离子螯合等）或生物化学(抗体、受体、核酸等）处理，可以特异性地与样本中的蛋白质结合，并与激光解吸电离飞行时间质谱联用，绘制蛋白质指纹图谱;表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF MS）将芯片技术和质谱技术相结合，集蛋白质样品前处理、生物分子反应、检测分析过程于一体，实现了高效、快速、高通量的检测。国内外学者曾经针对该技术进行了较为系统的综述［46，47］。SELDI 芯片可以用于血清、尿液、乳房分泌液、细胞破碎液等样本中LMWP疾病标志物的筛查分析，但由于SELDI仪器精度、串级分析限制以及实验操作重现性等问题，芯片的使用受到了一定的限制。Zhang等［48］利用不同萃取机理芯片(IMAC3-Cu、SAX2、H50以及 WCX2）萃取富集血清中的LMWP，并结合SELDI-TOF MS在早期卵巢癌血清中筛查到载脂蛋白、转甲状腺素以及蛋白酶抑制剂H4多肽(3272 Da）潜在分子标志物。Peng等［49］将IMAC-Cu SELDI芯片与四极杆飞行时间质谱进行联用，在m/z＜6 kDa范围内鉴定了血清中21条 LMWP的序列。Winder等［50］将 IMAC-Cu芯片应用于48对乳腺癌血清标本分析，发现了蛋白酶抑制剂H4多肽、精氨酸过敏毒素C-末端片段等潜在分子标志物。由于SELDI芯片在LMWP富集处理过程中具有方便、快捷、高通量的特点，其与新一代仪器的联用在疾病早期诊断中有着远大的应用前景。

3.3.2 磁性富集材料

磁性材料的表面可进行多种衍生化处理，其结合外磁场作用易于分离的特点也被生物学家用于LMWP的提取和富集。Villanueva等［51］采用不同长度碳链修饰的磁珠材料发展了一种血清多肽富集新方法，发现 C8磁性微球(magnetic beads，MB）比MB-C1、-C2、-C3、-C18对 LMWP 的选择富集能力更强，在50 μL 血清发现了 400 种 LMWP(0.8 ～1.5 kDa）;与乙醇沉淀、30 kDa MWCO超滤方法、亲和色谱柱(Cibachron Blue填充物）提取富集LMWP相比，MB-C8对 LMWP有更好的回收率。Tiss等［52］则评价了 MB-C8、-C18、-WCX、Zip-tip C18以及 DBC18对血清中LMWP的富集能力以及重现性，指出MB-C8具有高富集能力，但重现性较差(变异系数(CV）=62.1%）;理想的处理方式为 Zip-tip C18，其在保证464个检出峰时重现性仍维持较好的水平(CV=23.2%）。Baumann 等［53，54］采 用MB-HIC、MB-C8、MB-IMAC Cu、MB-WCX 分别建立了提取富集血清和尿液中LMWP的标准流程，并在1～10 kDa质谱扫描范围内分别获得了350个和427个LMWP信号。Gatlin等［55］则采用2%(v/v）三氟乙酸变性处理-50 kDa MWCO超滤-MB-C3富集联用技术富集血清中的LMWP，该方法比超滤、超滤-SPE方法有更好的回收率和重现性。此外，MB-C8(一步法合成）、MB-f-C60、MB-油酸、MB-碳多糖-C8等新型磁性材料的发展也为LMWP的提取富集提供了新的选择空间［56-58］。但大多数研究者没有考虑新型磁性微珠制备批次对样本处理重现性的影响，从而使其在实际临床样本中的应用存在一定的限制。

3.3.3 纳米材料

纳米材料具有高比表面积、表面多官能团、纳米孔径等特性，对生物分子具有优越的富集能力，因此纳米材料也被用于多肽或蛋白质的富集分离。

碳纳米材料(如碳纳米管、纳米金刚石、富勒烯、石墨烯等）具有多电子轨道特性，与疏水性化合物形成π-π作用，也可通过表面官能团与化合物形成静电作用，从而对多肽和蛋白质具有富集能力。武春霞等［59］曾针对碳纳米管在分离科学中的应用进行了详细的综述。Li等［60］建立了碳纳米管富集血浆中LMWP的新方法，比C18、C8硅球具有更强的富集能力，在50 μL血浆中鉴定到374条内源性肽。Vallant等［61］则首次将C60及其衍生物用于血清肽组学研究，建立了完整分析2～30 kDa LMWP的新策略。纳米金刚石也被用于分析尿液和血清中的LMWP［62］。聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA）与多肽或蛋白质具有很强的疏水作用力，Yin等［63］采用PMMA衍生化石墨烯(石墨烯@SiO2@PMMA）用于鼠脑中疏水性神经肽的选择性富集。

无机纳米材料则通过静电作用、疏水作用以及体积排阻等特性使HMWP排除在材料孔径外侧，小于孔径的LMWP则可以被提取富集。纳米沸石最早用于溶液中多肽的富集分离，随后不同孔径的纳米硅材料以及芯片也被用于LMWP的提取。Tian等［64］比较了不同孔径(2 nm、8 nm、12 nm）的 MCM-41纳米硅球对血清LMWP的提取富集能力，发现2 nm MCM-41可以有效截留12 kDa的HMWP，对1～12 kDa的LMWP具有明显的富集提取能力。调节血清pH为2.5并结合2D-LC-MS/MS分析，在4 mL血清样本中得到了1680条特异性肽［65］。由于MCM-41材料对疏水性肽具有特殊的富集能力，为提高对血清中LMWP的富集能力，该课题组采用新型有序介孔碳材料(ordered mesoporous carbon material，OMC）对血清中LMWP进行提取富集，4.8 nm的OMC可以截留大于10 kDa的HMWP，即使对＜2 kDa的多肽仍然具有很好的提取富集能力;与2DLC-MS/MS联用，在20 μL血清中富集鉴定到3402条内源性肽［66］。根据上述无机纳米材料富集LMWP的特点，科研工作者也合成了其他新型纳米孔径材料并用于血清、诱导痰、组织提取液等样本中LMWP的提取富集，如介孔硅球［67］、介孔有机硅微球［68］、介孔硅铝［69］、C8-石墨烯-修饰介孔硅材料［70］等。通常采用离心方式对上述无机纳米材料进行收集，但该收集方式费时，并对样本体积有所限制。为方便、快捷地处理大体积样本，磁性材料与纳米孔径结构材料复合体获得了发展，如介孔硅磁性微球(MB@nSiO2@mSiO2、MB@mSiO2）以及 C8-、Cu2+、氨基等修饰的磁性多孔硅球MB@mSiO2-C8、MB@mSiO2-Cu2+等被用于LMWP的富集分离，从而大大缩减了样品前处理时间［71-73］。Zhu 等［74］则将制备的有序介孔二氧化硅纤维填充在注射器进样针头尾部，更加方便地实现了样品的载样、清洗、洗脱过程(3 min），大大提高了实验效率以及实验重现性。上述大多数材料需要将LMWP洗脱、浓缩后进行质谱分析，为提高LMWP分析的回收率、重现性以及实验效率，Ferrari等［75］通过三嵌段共聚物模板途径制备了3D介孔硅芯片，实现了原位富集、清洗、洗脱，成为传统纳米材料在LMWP提取富集中的一大创新。根据致孔剂的不同，该课题组获得了3.7 nm、5.2 nm、7.4 nm、9.0 nm 孔径的芯片，结果表明 3.7 nm和9.0 nm孔径芯片可以分别对900～3500 Da和3600～8500 Da范围内的多肽进行特异性的富集。同时该芯片对LMWP具有一定的存储能力，富集LMWP的芯片室温放置3周后LMWP各峰的峰强的变异系数仅为12.7%，因此该芯片有望在临床诊断标志物筛选中得到应用。Tan等［76］则采用电刻蚀方法制备了不同孔径的多孔硅微粒，富集LMWP的材料无需洗脱，可以直接在MALDI靶板上进行质谱分析。该方法在大肠癌血清肽组学研究应用中，鉴定分析到82条内源性多肽。上述纳米材料在富集复杂体系中的LMWP时，为保证孔径对HMWP的排阻能力，样本尽量维持了其三维结构而没有进行任何变性处理，因此不仅丢失了与HMWP有作用的LMWP，而且很难消除水解酶对样本的降解作用，在实际应用中存在一定的局限性。

对于其他无机纳米材料(如纳米金(银）、金属有机骨架材料等）也可以通过静电和疏水作用力提取富集多肽。Sudhir等［77］建立了一种以纳米金辅助单液滴微萃取多肽的新方法，即以分散纳米金的甲苯为萃取相，通过调节溶液pH值(pH＜pI）使多肽得到微萃取富集。虽然该方法没有直接用于样本中LMWP的富集，但是其特点完全可以应用于LMWP的提取富集。比表面积大、稳定性好、纳米孔径的金属有机骨架材料也被用于提取富集血清及尿液中的LMWP［78］。其他有机聚合胶束纳米材料在对LMWP的富集提取中也有不俗的表现［79］。纳米材料对LMWP的提取富集具有富集能力强、特异性显著、不受样本体积限制等特点，但是由于大多数纳米材料在处理样本中的LMWP时存在重现性评价问题，因此需要切实有效地建立和优化标准，为实际应用铺平道路。

3.3.4 限进材料

限进材料(restricted access material，RAM）是一种混合模式的固相萃取吸附剂，同时兼具对大分子的体积排阻功能和对小分子分析物的富集功能。该材料通过合适的孔径使得生物大分子不能进入材料内孔;而孔内修饰的疏水或离子交换基团可实现对小分子分析物的萃取;并且亲水性的外表面会保证对生物大分子不发生不可逆变性和吸附;因此RAM被广泛应用于复杂生物样本、环境样本的预处理［80］。样本中LMWP与HMWP的显著差别就在于分子尺度的大小，因此RAM更加适合在线提取富集LMWP。Wagner等［81］利用硅质 RAM 填充柱建立了比较繁琐的二维离线富集分离系统，分析了成纤维细胞裂解液中＜20 kDa的LMWP，15个色谱峰的保留时间、峰面积以及峰高相对标准偏差控制在 0.04% ～ 2.41%、6.6% ～ 35.6% 以 及 4.4% ～25.6%之间(n=6）。Hu等［82］制备了体现强阳离子交换和体积排阻特征的RAM并与nano-C18反相色谱柱在线联用，实现了血清中＜15 kDa LMWP的富集分析。采用一维色谱分析2 μL血清样本时，获得了400条内源性多肽，3次技术重复达60%，峰的保留时间与峰强度的相对标准偏差控制在0.5%以及4%～25%之间，相比Wagner等建立的系统有更好的重现性。该系统同样可以实现LMWP的多维分析，20 μL血清样本中鉴定到的内源性肽达到1286条，良好的重现性为准确定量研究LMWP奠定了坚实的基础。虽然在线RAM富集程序可以自动运行，但为获得LMWP高的回收率，RAM填充柱在线富集的流速、pH、样本稀释倍数以及上样量需要进一步的优化。

基于RAM材料的设计理念，一种体积排阻-亲和水凝胶纳米颗粒材料(size-exclusion-affinity hydrogel nanoparticles，SEAN）也得到了发展，材料内部固定了目标分子“诱饵”，而外壳水凝胶形成不同尺度的孔径，对HMWP进行体积排阻并特异性富集目标分子，因此该材料兼顾了体积排阻色谱和亲和色谱的特点。面对生物样本复杂体系下LMWP富集分离的难题，该技术也发挥了它的优势。Luchini等［83］首次提出了以N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸复合纳米颗粒作为富含负离子的SEAN对LMWP富集进行了系统的考察和评价，分子截留能力＜14400 Da。而且其他科研工作者也发展了不同的“诱饵”，如:烷基胺、Cibacron Blue F3G-A、苯硼酸类、TiO2等，对样本中的负电性LMWP、多肽、多聚糖、糖肽、核酸类以及磷酸化肽进行了选择性富集［84-86］。Luchini等［87］发展了含有17种“诱饵”的多聚水凝胶核壳纳米颗粒，用于广泛富集血清中＜30 kDa的LMWP，获得了200种低丰度LMWP，该方法将鉴定低丰度蛋白质的浓度丰度扩大了5个数量级。SEAN有效结合了体积排阻和亲和富集的特点，可以对LMWP进行有效富集;但SEAN为多聚水凝胶材质，其对温度、外界压力的耐受程度有限，通量性也受到了限制。结合RAM和SEAN的特点，Tian等［88］对4.8 nm MCM-41 纳米孔径硅材料进行了强阳离子(SCX）和强阴离子(SAX）的修饰，将SAXMCM-41和SCX-MCM-41两种材料与在线2D-LCMS/MS联用在小鼠肝脏提取液中获得了2721条内源性多肽。该课题组又将Ti(Ⅳ）固定于MCM-41纳米孔内，以Ti为吸附“诱饵”、材料孔径为体积排阻“筛孔”，对血清中内源性磷酸化肽进行了特异性富集，并结合iTRAQ技术发现了人类肝癌血清样本中潜在的磷酸化内源性多肽标志物［89］。Zhu等［90］将Ti(Ⅳ）-MCM-41用于500 μL人血清中内源性磷酸化肽的富集，并结合反相液相色谱离线分离以及碰撞诱导碎裂和电子转移裂解(CID和ETD）模式获得了143条磷酸化内源性肽(133个磷酸化位点，其中109个为首次报道），开启了血清后修饰内源性肽的特异性富集鉴定研究。Liu等［91］则采用氨基苯硼酸对MCM-41进行修饰，在大鼠血清中获得了15条糖基化内源性多肽。上述新型RAM离线富集材料如可以实现在线富集能力，将为血清中LMWP以及后修饰的LMWP富集鉴定分析提供更优异的平台。

3.4 其他技术

除上述技术外，传统的分离分析技术，如体积排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC）、亲和色谱(affinity chromatography，AC）、电泳技术以及电渗析技术等也被常用于提取富集LMWP。Hu等［92］利用SEC与LC-MS/MS联用分析了小鼠肝脏提取液中的LMWP(Mr＜3000 Da），鉴定得到归属于371种蛋白质的1181条内源性多肽。但SEC的缺点是分辨率低，需要与其他多维分离技术联用方可实现LMWP的鉴定检出。针对血清等体液样本，体系内蛋白质或多肽的含量跨越约12个数量级，亲和色谱也被广泛用于高丰度HMWP的剔除，使低丰度LMWP得到富集。Shen等［93］采用AC去除高丰度蛋白质后，以SEC技术进行＜20 kDa LMWP的提取富集并与LC-FT-MS/MS联用，在人类血浆中获得了归属于29种蛋白质的200条内源性肽。在采用十二烷基磺酸钠强变性剂有效消除LMWP与HMWP的相互作用后，通过连续凝胶电泳分离，获得了LMWP的提取富集，去除十二烷基磺酸钠后进行LMWP的鉴定分析。该体系样本承载量范围广，但是后续需要去除强变性剂，增加了样本处理步骤，可能引起LMWP的部分损失。新型选择电泳MF10分离装置是以聚丙烯酰胺膜(65 kDa、25 kDa、5 kDa、1 kDa）为分离膜，在电场作用下，蛋白质或多肽根据不同尺寸和流动相pH进行不同分子量范围的收集，采用该技术检测尿素变性处理后的血浆样本，在1～5 kDa范围鉴定到归属于22种蛋白质的77条内源性肽［94］。该技术所需最小样本量在100 μL左右，使用范围受到限制;同时由于多聚物膜的使用，存在非特异性吸附现象。

Kamphorst等［95］采用电渗析技术，鉴定了类风湿性患者滑膜液中归属于12种蛋白质的27条内源性多肽，但该技术的重现性和回收率不理想。

Tanaka等［96］发展了一步电转印结合 MALDIMS进行肽组学分析的新方法，样本直接采用凝胶电泳分离，凝胶通过电转印到聚偏氟乙烯树脂膜(PVDF）上，再进行MALDI-MS分析。采用该方法在妊娠高血压孕妇血清样本中发现了23条特异性内源性多肽，为其早期预警提供了潜在的分子标志物。虽然该技术实现了HMWP非剔除条件下肽组学的直接分析，但仍存在以下问题:4%～12%的凝胶电泳以及转膜操作过程损失更多LMWP，从而影响LMWP的回收率和鉴定检出效率;PVDF膜上LMWP的MALDI-MS分析影响LMWP的检出灵敏度，因此该方法对LMWP的定量分析存在一定的局限性。

不同的样品前处理方法具有不同的特征和优势，我们以血清肽组学研究为例，将上述样品前处理技术鉴定的血清多肽情况进行概括(见表1）。总体而言，固相萃取技术在选择性和灵敏度上具有显著的优势;有机溶剂沉淀技术具有高通量、低成本、载样体积大的特点;超滤以及其他技术在选择性上也有独特的特点;因此需要兼顾各方法的优点进行肽组学样品前处理方法的选择。

表1 各种肽组学样品前处理技术对血清标本中LMWP鉴定情况的比较Table 1 Comparison of methods used for serum peptidome enrichment and identification

4 结论与展望

综上所述，面对易受水解酶影响的多肽组学，样本准备以及前处理过程需要建立标准程序，更严谨地为临床疾病诊断寻找潜在的分子标志物。复杂样本体系中大量高丰度蛋白质的存在是肽组学发展面临的最大挑战，因此发展快速、有效、高通量、自动化的样品前处理方法和技术势在必行。目前富集LMWP的策略仍然延续高分子量或高丰度蛋白质剔除方式，因此在样品前处理前解离与高分子量或高丰度蛋白质作用的LMWP对于提高LMWP的鉴定检出非常重要。同时高分子量或高丰度蛋白质的剔除将影响LMWP的回收率和重现性，最理想的方法是分离分析以及鉴定仪器获得大的突破，使样品无需经过任何前处理就可获得LMWP的信息。

上述肽组学样品前处理方法和技术有各自的特点，为扩大LMWP的检测范围可以任意组合使用。同时针对其他后修饰内源性多肽(乙酰化、甲基化等）的分析，目前仍需要发展新的方法和技术。面对新方法和技术大量涌现的局面，如何将新方法和新技术标准化并商业化也是肽组学产业化发展面临的问题。

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