异硫氰酸苯酯柱前衍生法测定复方氨基酸注射液(3AA)中氨基酸含量*

2013-10-22黄哲甦

天津药学 2013年4期

张莹，黄哲甦

(天津市药品检验所，天津 300070)

复方氨基酸注射液(3AA)为复方制剂，由缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸配制而成，可用于各种原因引起的肝性脑病、重症肝炎以及肝硬化、慢性活动性肝炎。亦可用于肝胆外科手术前后。该品种现收载于卫生部药品标准(二部)第六册(生化药品第一分册)中，国外药典未见收载。原质量标准中含量测定仅规定用适宜的氨基酸分析仪或高效液相色谱仪测定氨基酸的含量，因目前国内使用氨基酸分析仪分析该品种的情况较少，多数情况下使用柱前衍生高效液相色谱法进行测定，且柱前衍生法可采用几种不同的方法，如:PITC、DNFB、AQC等方法，不同的方法需要制备合适的对照品溶液和供试品溶液的浓度，以及采用不同的衍生试剂等。考虑到原标准检验方法的可操作性较差，对样品质量的仲裁带来一定的难度，因此本文采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液(3AA)的含量［1］，该方法具有准确、快速和灵敏度高等优点。

1 仪器与试剂

Agilent 1100液相色谱仪。复方氨基酸注射液(3AA)由天津天安药业股份有限公司提供(批号201007152、200906206、201002221)。对照品缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸及正亮氨酸(批号均为1406424－200805)均购自中国药品生物制品检定所。无水醋酸钠(天津市文达稀贵试剂化工厂)为分析纯，异硫氰酸苯酯为化学纯，乙腈为色谱纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件色谱柱:Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm);流速:1.0 ml/min;柱温:40 ℃;检测波长:254 nm，各种氨基酸的理论板数均大于20 000，分离度均大于2.0。流动相:A为0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH 6.5)－乙腈(93∶7);B为乙腈－水(80∶20)，梯度洗脱程序见表1。

2.2 溶液制备

2.2.1 内标溶液取正亮氨酸适量，加水溶解并稀释制成每1 ml中约含0.8 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液精密称取缬氨酸对照品约50 mg、亮氨酸对照品约65 mg、异亮氨酸对照品约50 mg，置同一250 ml量瓶中，加水适量，60℃水浴加热溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀;精密量取5 m l，置10 ml量瓶中，精密加入内标溶液2 ml，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

表1 梯度洗脱程序

2.2.3 供试品溶液精密量取本品2 ml，置50 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，精密加入内标溶液2 ml，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 衍生和测定方法精密量取对照品溶液和供试品溶液各2 ml，分别置具塞试管中，精密加入1 mol/L三乙胺溶液－乙腈(14∶86)1 ml，0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液1 ml，摇匀，在50℃水浴中反应45 min，取出，放冷;再分别精密加入正己烷1 ml，摇匀，放置30 min后(溶液至澄清)，取澄清的下层液各2 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算含量，见图1。

图1 对照品(A)和样品(B)色谱图

2.4 线性关系考查精密称取缬氨酸对照品约100 mg、亮氨酸对照品约130 mg、异亮氨酸对照品约100 mg，置同一250 ml量瓶中，加水适量，60℃水浴加热溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液;分别精密量取对照品贮备液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml置10 ml量瓶中，精密加入内标溶液2 ml，用水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液2 m l进行衍生，按上述色谱条件测定峰面积，结果表明:缬氨酸在浓度为19.942 ～159.536 μg/ml范围内峰面积与其呈线性关系，线性方程为:Y=－28.0+7.329 X(r=0.9995);亮氨酸在浓度为 26.176 ～ 209.408 μg/ml范围内峰面积与其呈线性关系，线性方程为:Y= －41.52+6.877 X(r=0.9998);异亮氨酸在浓度为19.794 ～158.352 μg/ml范围内峰面积与其呈线性关系，线性方程为:Y= －1.70+6.797 X(r=0.9998)。

2.5 稳定性考查取衍生后的供试品溶液，放置0、1、2、3、4、6 和 24 h 分别进行测定，结果亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸峰面积的RSD值分别为0.56%、0.73%和0.31%。表明供试品溶液中亮氨酸、缬氨酸和异亮氨在24 h内均稳定。

2.6 重复性考查取同一批号(200906206)样品6份，按照上述方法分别进行测定。结果样品中亮氨酸平均含量为99.3%，RSD为0.87%;缬氨酸平均含量为99.1%，RSD为 0.96%;异亮氨酸平均含量为97.9%，RSD 为 0.66%。

2.7 回收率考查分别称取亮氨酸对照品约52、65和80 mg，缬氨酸和异亮氨酸对照品约40、50和60 mg各3份置250 ml量瓶中，加水适量，60℃水浴加热溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀;精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，精密加入内标溶液2 ml，用水稀释至刻度，摇匀，照含量测定方法进行衍生和测定，亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸平均回收率分别为:99.6%(RSD 为 0.43)、98.5%(RSD 为 0.52)和 99.2%(RSD为 0.49)。见表 2。