组合树脂技术纯化葛根中葛根素工艺研究*

刘金平，汤树良，袁 航，郑志刚，刘长青

(1.江苏天士力帝益药业有限公司，淮安 223002;2.天津天士力集团，天津 300402;3.北京中医药大学中药学院，北京100029)

野葛［Pueraria Lobata(Willd)Ohwi］根中富含葛根素，是一种异黄酮类化合物，具有降低心肌耗氧量、改善局部微循环障碍等多种药理作用［1］。近年来，鉴于葛根素治疗心血管疾病的疗效较好，高纯度的葛根素提取物市场需求急剧上升。大孔吸附近年来被广泛应用于天然产物的提取分离［2，3］。目前仅有李君剑等［4］采用AB－8型大孔吸附树脂纯化得葛根素纯度为25%的提取物，未看到葛根素纯度更高的研究报道。本实验采用组合树脂技术对葛根药材进行了研究，较好地实现了高纯度葛根素提取物的简捷产业化生产，并为组合树脂技术在工业化大生产方面的应用开创先例及奠定了一定的基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters Alliance高效液相色谱仪，包括2695 Separations Module四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，Waters 2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站，BüCHI Rotavapor R－200旋转蒸发仪(瑞士BüCHI公司)。

1.2 试剂与样品 预制硅胶H板(青岛海洋化工厂分厂);乙腈(美国Fisher公司)为色谱纯，甲醇、乙酸乙酯、正丁醇(北京化工厂)和乙酸(北京化学试剂公司)均为分析纯，水为重蒸馏水;葛根素对照品(批号110752－200209，中国药品生物制品检定所);实验中所用的药材来自陕西商洛药源基地。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［5］HPLC色谱柱:Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 － 水(25∶75);流速:1.0 ml/min;检测波长:250 nm;进样量:5 μl;柱温:30℃。在此条件下葛根素保留时间约在14 min。TLC展开剂:三氯甲烷 －甲醇 －水(7∶2.5∶0.25)，紫外灯365 nm下检视。

2.2 葛根素对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品适量，加甲醇制成0.0418 mg/ml的葛根素对照品溶液。

2.3 葛根素提取物制备工艺路线，见图1。

图1 葛根素提取物制备工艺路线

2.4 试验结果 分别以20、40、48、50和50 kg葛根药材，按工艺路线进行了5批试验，得提取物，各精密称取5.0 mg提取物粉末于50 ml量瓶中以甲醇定容，过0.45 μm微孔滤膜，续滤液作为供试品溶液。在上述色谱条件下分析，结果表明该工艺路线稳定、可靠，可进行工业化生产，见表1。

表1 5批提取物中葛根素含量检测结果

3 讨论

3.1 工艺用树脂及水解条件的考查

3.1.1 第一步树脂筛选考查 对 AB－8、D－392、S－8、D －390、D －4020、H －103、NKA、NKA －9 和K－5九种树脂进行筛选，称取500 g粉碎葛根药材，按工艺路线提取得提取液。将提取液分成九等份，分别过九种树脂装填柱(ф 3 cm×40 cm)，柱体积约150 ml;收集过柱液，再以3倍体积水洗脱;从大工业化生产的简捷、快速、成本低廉方面考虑，采用药典薄层方法监测过柱液和水洗液。结果表明，同等条件下D－392、D－390、S－8三种树脂能较好吸附有效成分葛根素。见表2。

表2 薄层色谱法对大孔树脂洗脱液监测结果

3.1.2 树脂容量的选择——葛根素泄漏实验研究称取200 g粉碎葛根药材，按工艺路线提取得提取液，将提取液均分为三等份。同上方法对D－392、D－390、S－8三种树脂装柱进行筛选，再以HPLC监测其泄漏情况。以流出液中葛根素浓度为纵坐标，流出体积为横坐标作图，得泄漏曲线。结合三张泄漏曲线图，并考虑树脂的再生难易及对溶剂洗脱能力以及药材与树脂比，从中选择了D－392大孔吸附树脂，见图2。多批50 g粉碎的葛根药材按工艺路线经第一步树脂纯化得提取物，在“2.1”项下色谱条件下分析，所得色谱图见图3。计算葛根素提取物纯度为20% ～30%。

3.1.3 水解条件考查 查阅大量文献，鉴于葛根素为碳－糖结合，采取水解［6］工艺可水解除去以碳－氧－糖连接的类似结构的化合物，提高葛根素提取物的纯度。因盐酸分子小，比较活泼，其催化水解反应对设备的腐蚀性大，环境污染严重等，不利于大生产;而硫酸分子较大，酸性较强，其催化水解效果好。综合考虑，选择硫酸催化。此外，从生产成本、工艺处理工时及环保因素考虑，确定1% ～2%(V/V)硫酸液。称取纯度为20% ～30%的葛根素提取物50 g两份，均加入4倍量的1% ～2%(V/V)硫酸液溶解后分别水解3～4 h和5～6 h，水解液调近中性，并在水解液的基础上再稀释至5倍体积，滤过得滤液。分别取滤液按《中国药典》薄层方法进行监测，结果表明3～4 h已水解完全。

3.1.4 第二步树脂考查 将水解后处理后得到的提取物，液相监测其葛根素含量为30% ～40%。可看出水解后葛根素含量提高，但仍有杂质影响，需进一步筛选树脂纯化。对AB－8、D－392、S－8三种树脂进行考查，称取250 g葛根粗提物粉末，按工艺路线提取经第一步树脂纯化和水解并处理后得水解液，将水解液均分3等份。分别过3种树脂装填柱(ф 3 cm×40 cm)，柱体积约150 ml;收集过柱液，再以3倍体积水洗脱;以《中国药典》薄层方法监测过柱液和水洗液。结果表明，同等条件下D－392、S－8两种树脂均能较好吸附有效成分葛根素，见表3。

图2 葛根药材提取液

在D－392大孔吸附树脂的泄漏曲线

图3 对照品(A)D－392纯化粗提物(B)HPLC色谱图

表3 薄层色谱法对大孔树脂洗脱液的监测结果

3.1.5 树脂容量的选择——葛根素泄漏实验研究称取100 g葛根粗提物粉末，同上法处理得水解液，均分2等份。以“3.1.4”项下方法分别过 D －392、S－8两种树脂所装柱进行筛选，再以HPLC监测其泄漏情况。以流出液中葛根素浓度为纵坐标，流出体积为横坐标作图，得泄漏曲线。结合各泄漏曲线图并考虑树脂的再生难易及对溶剂洗脱能力，以及药材与树脂比，从中选择了S－8树脂富集吸附。见图4。以多批粗提物进行水解再以S－8纯化得提取物，计算得提取物纯度均大于55%。

图4 S－8大孔吸附树脂对葛根粗提物水解液的泄漏曲线

3.2 其他

3.2.1 按本工艺路线进行葛根药材提取分离，除了得到约2%收率、葛根素含量55%以上的高纯度提取物外，还可以得到约1%收率的大豆异黄酮提取物，但其纯度未做进一步的考查。

3.2.2 本提取分离纯化工艺路线先进、简捷、周期短，成本低廉，适合于工业化大生产。

1 朱庆磊，吕欣然.葛根素的药理学和临床应用研究进展［J］.中草药，1997，28(11):693

2 陈延清.用七种不同大孔吸附树脂精制乐脉胶囊的研究［J］.中成药，2001，23(8):553

3 米靖宇，宋纯清.大孔吸附树脂在中草药研究中的应用进展［J］.中成药，2001，23(12):914

4 利剑君，李稳宏，高新，等.AB－8型大孔吸附树脂吸附葛根素过程的研究［J］.西安交通大学学报，2000，34(4):78

5 中国药典［S］.一部.2010:附录36

6 潘娓婕，刘谦光.酸水解法从葛根中提取分离葛根素和大豆苷元［J］.天然产物研究与开发，2000，12(6):66