人CYP 的异源表达及其在新药研发早期的作用

谢章明，陈枢青 综述

(浙江大学药学院 药理毒理与生化药学研究所，浙江 杭州 310058)

在新药研发过程中，药物的代谢过程及药物与其他药物的相互作用是新药研发早期安全性评价的关键。在新药研发的早期就开展药物代谢及药物-药物相互作用(drug-drug interaction，DDI)的研究，将有助于获得安全、有效的治疗药物［1］。而异源表达系统可以高效、大量获得较高活性的重组人药物代谢酶，从而在体外对某一个单一的药物代谢酶进行研究［2］。在实际的研究过程中，人们尝试比较了多种表达系统，其中杆状昆虫表达系统［3］不仅表达量高，具有正确的糖基化、磷酸化和组织定位表达等优点，而且所表达的蛋白生物学特性与天然蛋白相似，可以将其建立高预测能力的代谢模型，对临床用药有很大指导意义。

1 人细胞色素P450 异源表达

细胞色素P450 是一大类含有铁卟啉辅因子的蛋白超家族。CYP 酶对内源性物质(包括类固醇、脂肪酸和胆固醇等)和外源性物质(包括药物、致癌物、环境污染物、杀虫剂和草药成分等)的代谢是至关重要的［4］。然而，从人组织中纯化的细胞色素P450 不容易保持其原有的催化活性，且这种CYP 来源并不多，因此异源重组表达体系被越来越多的应用于CYP450的表达当中。到目前为止，几个常用的表达体系，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等均已被用于CYP450 的表达。

1.1 大肠杆菌表达系统 相对于真核表达系统来说，原核表达系统具有技术上较容易、操作简单、表达水平高、生产周期短等优点［5］。但是，原核表达系统也有许多不可避免的缺点，如蛋白翻译后的折叠和糖基化水平过于简单，表达的膜蛋白与哺乳动物蛋白结构相差较多。对于CYP450 在大肠杆菌中的表达来说，需要对所表达酶的氨基酸末端区域进行改造才能得到较高水平的表达［6］。另外，细菌中还缺乏CYP酶系催化反应的一些辅酶，因此会造成所表达的CYP450 没有活性。

1.2 酵母表达系统 酵母是第一个成功表达哺乳动物CYP450 的表达系统［7］。相对于原核表达系统来说，酵母具有较完整的细胞、亚细胞结构，在其中所表达的蛋白不易水解，且不易形成包涵体。而相对于哺乳动物细胞表达系统来说，酵母表达系统表达水平高，生产周期较短，适合大批量的工作，且酵母本身的细胞色素P450 氧化还原酶被证明在酵母细胞的电子传递中是有效的［8］。但是，酵母细胞在没有水解酶的情况下难以破裂，且表达载体不像细菌或哺乳动物系统上的载体容易获得。

1.3 哺乳动物细胞表达系统 用于表达人CYP 的哺乳动物细胞种类广泛，包括COS 细胞［9］、HepG2 细胞［10］、HK293 细胞［11］和CHO细胞［12］等。哺乳动物细胞表达系统接近人体内环境，且细胞本身含有辅助因子细胞色素P450 氧化还原酶和细胞色素b5等。但由于哺乳动物细胞的CYP 本底含量高，使得重组蛋白的表达量相对较低，且哺乳动物细胞表达生长周期较长，成本也高，因此该系统表达CYP 主要用于致突变和转染实验，而不常用于药物代谢酶的大量表达及药物的高通量筛选研究。

1.4 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 杆状病毒表达系统是以昆虫细胞(Sf 9 或Sf 21 等)作为表达宿主，直接以杆状病毒穿梭载体Bacmid转染昆虫细胞进行重组表达的一种表达系统。杆状病毒表达系统作为一种高效的真核表达系统，不仅具有表达水平高的优点，而且其翻译后的蛋白能够正确糖基化、磷酸化和组织定位表达，表达产物类似于天然产物［13］。但是，杆状病毒表达系统用于表达CYP 时，由于昆虫细胞中缺少血红素，因此需要在表达过程中人为加入血红素，并且需要控制血红素的加量。另外，由于杆状病毒宿主细胞内缺少CYP450 所需的电子转运体，所以用此方法表达的CYP 需要另外加入细胞色素P450 氧化还原酶或细胞色素b5才能发挥代谢活性［14］。

2 异源表达CYP 在新药研发早期的作用

2.1 CYP 的表达与药物代谢研究 在众多的药物代谢酶中，CYP 家族是药物生物转化过程限速步骤的主要酶系［15-16］。最初人们使用人组织制备的微粒体(如肝微粒体)进行药物代谢研究，由于人组织不易获得，且不同人的组织之间差异较大，因此无法进行药物的高通量筛选和代谢研究。另外，人组织中所获得的CYP酶是多种CYP 的混合物，难以进行单一酶的代谢研究［17］。随着分子生物学的发展，克隆和异源表达人CYP 成为可能。异源表达能获得单一的CYP，从而可以考查该酶对某种底物的代谢机制及动力学参数。另外，由于异源表达的CYP 表达水平高，只需对条件进行优化便可以将其应用于工业化生产，从而使药物的高通量筛选及体外代谢研究变得更加快捷、方便。

在新药研发的早期，药物代谢的研究不仅可以促进新化合物的筛选效率，而且还能提高其在临床上的成功率［15］。在新药的筛选与研发过程中，研究者通常运用两种不同的体外代谢研究方法来评价基于CYP 的潜在药物-药物相互作用［18］。其中一种方法是描述该新药的代谢途径以及其它药物对该新药代谢的潜在影响。另一种方法则是评价该新药对其它药物代谢的影响。这两种方法都需要研究不同的CYP 酶及底物。在药物-药物相互作用的研究中，人们发现底物和代谢环境的差异会对结果造成很大的不同，而CYP3A4 这种代谢酶在这个现象中尤为突出。Wang［19］等人研究了睾酮、特非那丁、咪达唑仑和硝苯地平这4 种常用CYP3A4 底物之间的相互抑制。他们发现，睾酮与特非那丁、睾酮与咪达唑仑以及特非那丁与咪达唑仑之间会部分相互抑制，硝苯地平也会抑制睾酮的6β-羟基化，但睾酮却并不抑制硝苯地平的氧化。Emoto［20］等人利用昆虫细胞表达系统共表达了CYP3A4、POR 和cyt b5，并将其用于基于内在清除率(intrinsic clearance)值的相对活性因子(relative activity factor)值的研究。他们认为，该方法对于某药物的代谢途径及潜在副反应研究具有很大贡献，因此对新药的筛选及早期开发也是非常有价值的。

2.2 CYP 突变体的表达与个体化用药 由于CYP 基因的多态性，因此不同人种以及同一人种的不同群体间都会携带不同表型的CYP 突变体。CYP 的这些突变体必然会引起其在代谢临床用药或环境污染物上的差异［21］。有些突变体相对于原来野生型的CYP 来说代谢活性变大了，这就会造成临床用药的药效下降;而有些突变体相对于原来野生型的CYP 来说代谢活性减弱或消失了，这又会造成临床用药的毒性增加［22-24］。对于某一种CYP(如CYP2D6)来说，可将不同表型的携带者分为超快代谢者、强代谢者、中间代谢者和慢代谢者［25］。

Liu［26］等人用杆状病毒表达系统在Sf 9 细胞中分别表达了CYP2A13* 1/* 2/* 4/* 5/* 6/* 8/* 9，并以香豆素为底物，分别对CYP2A13 的野生型及各种突变体进行代谢动力学分析。最终他们发现，相对于野生型来说，突变体CYP2A13* 2/* 5/* 6/* 8/* 9 的代谢活性有一些改变，但改变幅度不大;而突变体CYP2A13* 4 对香豆素的代谢活性则完全丧失。

目前，药物基因组学已被用来建立遗传多态性和药效差异之间的关系，这将会促进个体化医疗的发展［27］。另外，研究遗传因素对药物代谢动力学的影响，探明药物代谢多态性、代谢的种族差异以及程度大小，可以指导优化治疗方案，实施个体化药物治疗，从而使疗效最优化，并使药物副反应降至最低［28-29］。因此，用定点突变异源表达的方法克隆表达出各种不同的CYP 突变体，并将其用于临床药物的代谢检测，有助于了解不同CYP 突变体对某种药物的代谢能力，从而为基因多态性数据库的建立及个体化治疗的方案提供宝贵的参考数据。

综上所述，人体内的药物-药物相互作用可能导致严重的副反应，因此包括美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)在内的许多机构都对新药开发时体内和体外的药物相互作用研究做了明文规定［30］。在体外药物相互作用的研究中，基于CYP 代谢的药物相互作用研究是主要研究对象［31-32］。人们不仅研究了各种CYP 酶的探针底物及抑制剂，还研究了各种CYP 突变体对药物代谢及药物相互作用的影响。由于人肝微粒体中的CYP 是多种CYP450 酶的混合，而FDA 规定新药在临床前必需要明确该药物是由哪种酶代谢的［33］，因此人们开始通过各种表达系统来表达并纯化单一的P450 酶，并将其用于体外的探针底物及抑制剂研究，从而为体内的药物相互作用提供可靠的参考［15］，并提供判断新药研究过程中是否继续的依据;同时，与基因多态性相关的酶活性数据可以帮助提供临床个体化用药时剂量的选择依据。

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