辣椒素对大鼠肠系膜阻力血管的舒张作用及其机制

陈 强，朱欢欢，张媛媛，张 媛，王利宏，郑良荣

(1.浙江大学医学院附属第一医院心内科，浙江 杭州 310003;2.浙江大学医学院附属义乌医院心内科，浙江 义乌 322000)

辣椒素(capsaicin，CAP)是辣椒的活性成分，常常作为一种食品添加剂为人们食用，是瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)的高选择性激动剂。1997年，Caterina等成功克隆辣椒素受体，命名为香草酸受体亚型1(vanilloid receptor type1，VR1)，因与瞬时受体电位(TRP)家族的一些成员在氨基酸序列上有23%的同源性，又命名为TRPV1，是一种配体门控的非选择性阳离子通道［1］。TRPV1分布广泛，在心血管系统和肾脏组织中的初级感觉神经元中表达丰富［2］。CAP可激活TRPV1，引起感觉神经末梢CGRP、SP 等血管活性递质的释放［3-4］。

研究表明，CAP具有镇痛止痒、抗炎消肿、调节食欲和治疗消化道疾病、预防心血管疾病、防治风湿、抗癌和减肥等作用，长期CAP饮食还可降低和预防高血压［5-7］。目前为止，CAP急性激活TRPV1后血管舒张作用机制的研究多集中在大容量血管上，如主动脉，肠系膜动脉等，其对大鼠肠系膜阻力血管的舒张作用及机制未见报道。鉴于外周阻力血管在血压调节中重要作用，本研究使用离体大鼠肠系膜阻力血管来探讨CAP舒张效应及其内在机制。

1 材料和方法

1.1 实验试剂及动物 生理盐溶液(physiological salt solution，PSS)成分(mmol/L):NaCl 119，KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325、glucose 11.1、CaCl21.6，pH 7.4。辣椒素(capsaicin，CAP)、苯肾上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)、L-N-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P 物质 (substance P，SP)、CGRP8-37均购自Sigma公司，其余试剂为市售分析纯。CAP溶于乙醇溶液中，乙醇终浓度不超过0.1%，预实验表明，本实验中所用的乙醇浓度对肠系膜血管张力测定无影响。

雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250～350 g，购自浙江大学医学院实验动物中心。

1.2 实验方法 SD大鼠经水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后断头处死。在连续变倍体视显微镜下，将肠系膜上动脉三级血管迅速取出，移至预冷4℃通以95%O2+5%CO2的PSS液中。清除血管周围脂肪和结缔组织，避免损伤血管内皮，剪取长约2.0～2.5 mm左右血管环。根据实验需要，用大鼠触须摩擦血管环内表面去内皮。将血管环置于含5 ml PSS液的浴槽中，保持温度在37℃，pH 7.4，持续通以95%O2+5%CO2混合气体，悬挂于两段不锈钢金属丝中(直径0.039 mm)。其中，一段金属丝连于张力传感器上，另一段金属丝固定于肌动描记记录仪(DMT 610M，Denmark)的升降臂上。血管在浴槽中零张力静置30 min，而后调至静息张力，该张力相当于100 mmHg下血管直径0.9倍的张力。血管环在该张力下孵育30 min，每隔15 min更换一次PSS液。用KCl(6×10－2mol/L)预收缩，待收缩幅度稳定后洗脱，重复3次，以激发血管环的最大收缩活性。

观察血管环内皮完整性:浴槽中加PE(5×10－6mol/L)，收缩达峰值稳定后，加入 ACh(10－6mol/L)，观察血管环的舒张反应。若加Ach后使PE预收缩的血管舒张大于90%，可认为内皮完整;反之，内皮不完整，弃去。

观察血管环去内皮效果:触须摩擦去除血管内皮细胞后，浴槽中加PE(5×10－6mol/L)，收缩达峰值稳定后，加入ACh(10－6mol/L)，观察血管环的舒张反应。若加ACh后使PE预收缩的血管舒张小于5%，可认为去内皮成功;反之，去内皮不成功，弃去。

1.3 实验分组

1.3.1 测定CAP对PE预收缩肠系膜动脉环张力的作用 取内皮完整或去内皮的大鼠肠系膜动脉环，预检测稳定后，加入PE(10－5mol/L)，待血管环预收缩达到稳定后:采用累积加药方法，逐步增加 CAP 的浓度(10－9，3 ×10－9，10－8，3 × 10－8，10－7，3 × 10－7，10－6，3 × 10－6，10－5mol/L)，以加入CAP后血管张力幅度与PE诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比值来反映血管张力的变化，绘制CAP浓度-舒张曲线图;对照组累积加入不含CAP的PSS液，以血管张力自然下降幅度与PE诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比值来反映血管张力的变化。

CAP诱导的最大舒张反应(Emax)为CAP诱导的血管张力下降幅度占PE(10－5mol/L)诱发最大收缩幅度的最大百分比;应用Graphpad Prism 5.0软件计算半数有效浓度(EC50)，以 PEC50表示 －log［EC50］。

1.3.2 测定 L-NAME 及 CGRP8-37对 CAP诱导的舒张反应的作用 内皮完整的血管环稳定后，用 L-NAME(3×10－4mol/L)及 CGRP竞争性受体阻滞剂CGRP8-37(2×10－6mol/L)预孵育30 min后，加入 PE(10－5mol/L)，待血管环收缩稳定后，采用累积加药方法，逐步增加CAP 的浓度(10－9～10－5mol/L)。以加入 CAP后血管张力幅度与PE诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比值来反映血管张力的变化，绘制CAP浓度-舒张曲线图。

1.3.3 测定外源性CGRP对PE预收缩肠系膜动脉环张力的作用 取内皮完整或去内皮的大鼠肠系膜动脉环稳定后，加入PE(10－5mol/L)，待血管环预收缩达到稳定后，采用累积加药方法，逐步增加外源性CGRP的浓度(10－10，3 × 10－10，10－9，3 × 10－9，10－8，3 × 10－8mol/L)。以加入外源性CGRP后血管张力幅度与PE诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比值来反映血管张力的变化，绘制CGRP浓度-舒张曲线图。

1.3.4 测定SP对PE预收缩肠系膜动脉环张力的作用 取内皮完整及去内皮的大鼠肠系膜动脉环稳定后，加入PE(10－5mol/L)，待血管环预收缩达到稳定后，采用累积加药方法，逐步增加 SP 的浓度(10－9，10－8，10－7，10－6mol/L)。以加入SP后血管张力幅度与PE诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比值来反映血管张力的变化，绘制SP浓度-舒张曲线图。

2 结果

2.1 CAP对PE预收缩肠系膜动脉阻力血管的作用 图1示，与各自空白对照组(Con+E)、(Con-E)相比，CAP(10－8～10－5mol/L)对PE预收缩的内皮完整CAP实验组(CAP+E)、去内皮CAP实验组(CAP-E)的血管产生浓度依赖性舒张作用，其中内皮完整组的血管舒张作用比去内皮组更明显，两者相比CAP在10－7～10－5mol/L时，差异有统计学意义(P＜0.05，图 1)。CAP+E组 Emax值高于 CAP-E组，两者相比差异有统计学意义(P＜0.05，表1);同时，CAP+E组PEC50值低于CAP-E组，两者相比差异有统计学意义(P＜0.05，表1)。表明CAP对PE预收缩的大鼠肠系膜阻力血管舒张作用具有部分内皮依赖性。

图1 内皮对CAP舒血管效应的影响Fig.1 Effect of endothelium on capsaicin-induced relaxation in rat mesenteric arteries

表1 CAP对肠系膜动脉的最大舒张反应(Emax)及半数有效浓度(PEC50)Table 1 Emaxand PEC50for CAP in mesenteric arteries from rat

2.2 L-NAME及CGRP8-37对CAP诱导的舒张反应的作用 在内皮完整的肠系膜动脉环中，用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)阻断剂L-NAME及CGRP竞争性阻滞剂CGRP8-37预处理30 min。

2.2.1 L-NAME预处理组 在CAP浓度为10－7mol/L～10－5mol/L 灌流液中，NOS阻断剂L-NAME预处理组的血管张力大于CAP对照组(P＜0.05，图2A);L-NAME预处理可以显著减弱CAP浓度依赖性的舒血管作用，其Emax值为(86.77±4.92)%，而 CAP+E组 Emax值为(97.26±1.62)%，两者相比差异有统计学意义(P＜0.05，表1);其PEC50值高于对照组(P＜0.01，表1)。表明 L-NAME部分阻断了 CAP对PE预收缩的大鼠肠系膜阻力血管舒张作用。

2.2.2 CGRP8-37预处理组 在CAP浓度为3×10－8～10－5mol/L灌流液中，CGRP8-37预处理组的血管张力大于CAP对照组(P＜0.01，图2A)和 L-NAME组(P＜0.01，图2C);CGRP8-37可以显著削弱CAP浓度依赖性的舒血管作用，阻断血管舒张作用较L-NAME强，其Emax值低于CAP+E和L-NAME组Emax。前者与后两者相比差异有统计学意义(P＜0.01，表1);其PEC50值高于对照组(P＜0.01，表 1)。表明CGRP8-37部分阻断了CAP对PE预收缩的大鼠肠系膜阻力血管舒张作用，且阻断作用较L-NAME强。

2.2.3 L-NAME+CGRP8-37预处理组 在CAP浓度为3×10－8mol/L～10－5mol/L灌流液中，L-NAME+CGRP8-37预处理组的血管张力大于CAP对照组、L-NAME组和CGRP8-37组(P ＜0.01，图2B、2C);L-NAME+CGRP8-37 阻断了CAP浓度依赖性的舒血管作用，两种阻断剂具有叠加效应，其 Emax值低于 CAP+E、L-NAME和CGRP8-37组，与后三者相比差异有统计学意义(P＜0.01，表1);在 CAP各浓度下，L-NAME+CGRP8-37组血管张力与空白Con+E组相比，两者相比无统计学差异(P＞0.05，图 2B)。其 PEC50值低于 CAP对照组、L-NAME组、CGRP8-37组(P ＜0.01，表1)。表明L-NAME+CGRP8-37基本阻断了CAP对PE预收缩的大鼠肠系膜阻力血管舒张作用。

2.3 外源性CGRP对PE预收缩肠系膜动脉环张力的作用 图3示，与相应空白对照组相比，外源性 CGRP(10－10～3×10－8mol/L)对 PE 预收缩的内皮完整CGRP组(CGRP+E)、去内皮CGRP组(CGRP-E)的血管环均产生浓度依赖性的舒张作用。在CGRP浓度为3×10－9～3×10－8mol/L灌流液中，去内皮组血管张力显著大于内皮完整组(P＜0.05，图3)。CGRP+E组血管环的最大舒张反应Emax值为(100.26±1.26)%，血管舒张反应的半数有效浓度PEC50值 8.78±0.03，均显著高于 CGRP-E组Emax:(91.13±5.79)%和PEC50:8.57±0.04(P＜0.01，表2)。表明CGRP对PE预收缩的大鼠肠系膜阻力血管舒张作用具有部分内皮依赖性。

图2 L-NAME、CGRP8-37、L-NAME+CGRP8-37预处理对CAP舒血管效应的影响Fig.2 Effect of pretreatment with L-NAME，CGRP8-37 and L-NAME+CGRP8-37 on capsaicin-induced relaxation in rat mesenteric arteries

图3 内皮对CGRP舒血管效应的影响Fig.3 Effect of endothelium on CGRP-induced relaxation in rat mesenteric arteries

表2 CGRP对肠系膜动脉的最大舒张反应(Emax)及半数有效浓度(PEC50)Table 2 Emaxand PEC50for CGRP in mesenteric arteries from rat

2.4 SP对PE预收缩肠系膜动脉环张力的作用 如图4所示，在内皮完整的肠系膜动脉环中，SP(10－9～10－6mol/L)对 PE 预收缩的肠系膜动脉环无明显浓度依赖性舒张作用。

3 讨论

图4 SP舒血管效应的代表性张力记录图形Fig.4 Representative tracings showing SP-induced relaxation in rat mesenteric arteries

本实验首次表明，CAP可浓度依赖性舒张PE预收缩的大鼠肠系膜阻力血管，其机制涉及以下两方面:部分内皮依赖性的血管舒张作用，和NO合成及释放有关，可被NOS抑制剂LNAME阻断;另一方面和CGRP释放有关，可被CGRP竞争性阻滞剂CGRP8-37阻断。

之前研究表明，在内皮完整血管中，血管内皮细胞中的eNOS可催化L-精氨酸生成 NO，NO作为信号分子进入血管平滑肌细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，增加环鸟苷酸cGMP含量［8］;从而激活cGMP依赖性蛋白激酶使钙内流减少，增加肌浆网上钙ATP酶对钙的摄取或直接作用于收缩蛋白去磷酸化而使血管舒张［9］。本实验中去除内皮细胞或NOS抑制剂L-NAME预处理后显著削弱CAP的血管舒张作用，提示CAP的血管舒张作用可能通过NO途径介导。

CGRP是迄今发现的最强的内源性舒张血管物质，其扩血管作用比前列腺素(PG)、ACh、三磷酸腺苷(ATP)、5-羟色胺(5-HT)、SP、血管活性肽(VIP)以及异丙肾上腺素强，且对全身血管有不同程度的扩张作用，是一种广谱扩血管物质［10］。本实验发现，用CGRP竞争性阻滞剂CGRP8-37可显著抑制CAP介导的舒血管效应，提示CGRP在CAP舒血管效应中具有重要作用;合用L-NAME+CGRP8-37后基本阻断了血管舒张，表明CAP舒血管效应主要通过产生NO、CGRP两条路径发挥作用;同时CGRP8-37的阻断作用强于L-NAME，进一步表明CGRP在这两条路径中起到了主要作用。之前Brztz等研究发现，CAP呈剂量依赖性方式舒张猪冠状动脉，其舒张作用可被辣椒平(capsazepine，CPZ)、去内皮、NOS 和钾通道阻断剂阻断［11］;Yang等发现CAP舒张小鼠肠系膜阻力血管作用可被 L-NAME、CGRP8-37阻断［5］。同时也存在争议，Gupta等发现CAP舒张人和猪的冠状动脉不是通过 CGRP、NK1、NO、TRPV1 受体、电压敏感性钙通道、钾通道或cAMP介导的机制，而是可能通过非特异性、非CGRP依赖性机制［12］。此外，本实验还进一步研究了外源性CGRP舒血管效应，证实了CGRP对内皮完整和去内皮的血管均有浓度依赖性舒张作用，同时内皮完整组优于去内皮组。提示内皮途径部分参与了舒血管作用，CGRP对大鼠肠系膜阻力血管的舒张方式是部分内皮依赖性。这与之前Brain等研究表明，CGRP对兔的主动脉和肠系膜阻力动脉［13］、大鼠主动脉［14］、大鼠肺动脉［15］、人内乳动脉［16］内皮依赖性舒张方式不同，这可能和种属、部位器官、血管粗细差异有关。CGRP舒张血管方式分为内皮依赖性和非内皮依赖性［17］，具体机制目前还不十分清楚，有待进一步的研究。

CAP可激活TRPV1受体，引起感觉神经末梢CGRP、SP等血管活性递质的释放［3-4］。之前研究表明，SP是一种重要的神经传导介质，能够把疼痛瘙痒刺激由外周神经传入脊髓神经和高级中枢神经［18］;在人冠状动脉中，SP可内皮依赖性舒张血管［19］;SP的舒张机制可能与激活大动脉壁上NK1-R受体有关［20］。但本实验中，SP对PE预收缩的大鼠肠系膜阻力血管未见明显的舒张反应，表明了CAP舒血管效应是通过非SP途径实现。

综上所述，本实验结果表明，CAP对大鼠肠系膜动脉阻力血管具有浓度依赖性舒张作用，其具体机制包括两方面:部分内皮依赖性舒张血管，与其促进内皮细胞NOS-NO通路有关;另一方面，非内皮依赖性舒张血管和CGRP释放有关。

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