复方丹参片的HPLC特征图谱研究

宁夏医学院附属医院（750004）马启珍

北京市通州区药品检验所（101100）马启武△

复方丹参片是由丹参、三七、冰片组成的复方制剂，具有活血化瘀、理气止痛功效。其有效成分包含脂溶性的蒽醌类成分和水溶性的酚酸类成分。脂溶性蒽醌类成分包括丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮等10余种成分，统称为丹参酮，其中以丹参酮ⅡA含量较高；水溶性酚酸类成分包括丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和其他酚酸类成分[1][2][3][4]，水溶性成分可能是丹参治疗心血管疾病的主要有效成分之一[5]。笔者对市场上流通的不同厂家生产的10批次复方丹参片的甲醇提取液的特征图谱进行确定并对特征峰进行指认。

1 仪器与试药

日本岛津公司LC-20A高效液相色谱仪（SPD-M20A检测器）； MettLer XS205天平（十万分之一）；超声仪[由天津电子新技术（北京）有限公司提供]；丹参酮ⅡA对照品（批号：110766-200619）、隐丹参酮（批号：110852-2000305）、丹参酮Ⅰ（批号：0867-200205），均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇（色谱纯），纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 实验方法[6]

附图1 丹参酮ⅡA对照品

附图2 复方丹参片样品

附图3 阴性对照品

2.1 色谱条件 色谱柱：WondaSiL C18（150mm×4.6mm，5µm）；流动相：甲醇-水（73∶27）；检测波长：270nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃，理论塔板数按丹参酮ⅡA色谱峰计不低于2000。

2.2 对照品溶液制备 精密称取丹参酮ⅡA对照品10.25mg加入到100mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为储备液。取储备液4mL加入到10mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（40µg/mL）。进样量10µL。

2.3 供试品溶液制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）15min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液置棕色瓶中，即得。进样量10µL。

2.4 阴性对照品溶液的制备按处方比例，称取除丹参的其余饮片，按药典工艺制成颗粒，依上法制成阴性对照品溶液。进样量10µL。

3 方法学考查

3.1 干扰性试验 取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液依法进样，测定。供试品在与对照品相同的保留时间处有相同色谱峰，而阴性对照品没有出现，无干扰，见附图1～3。

3.2 线性范围考察 取丹参酮ⅡA 对照品储备液，精密量取2mL、4mL、6mL、8mL，分别加入到10mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成20.5µg/mL、41.0µg/mL、61.5µg/mL、82.0µg/mL、102.5µg/mL系列浓度标准溶液，按照上述色谱条件分别进样测定，分别精密吸取10µL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以质量浓度（Y）为纵坐标、相应的峰面积（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y＝aX+b，a＝8.6054×10-7，b＝0.0556，R＝0.99999。本次实验结果表明丹参酮ⅡA在20.5～102.5µg/mL范围内线性关系良好。

3.3 精密度和溶液的稳定性试验 取对照品溶液，连续进样5次，每次10µL，以色谱峰面积计算，测定结果的丹参酮ⅡA的RSD为0.06%，表明精密度良好。取对照品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，每次10µL，共进样6次，测定峰面积，测定结果的RSD为0.05%，表明丹参酮ⅡA溶液在24h内稳定。

3.4 重复性试验 取同一批样品内容物5份，按照供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取10µL，注入液相色谱仪，测定峰面积，测定结果丹参酮ⅡA的RSD为1.09%，重复性良好。

3.5 加样回收试验 分别称取6份同一样品约0.9g（批号：100615），分别精密加入对照品溶液25mL（精密称取丹参酮ⅡA8.09mg，精密加甲醇200mL，摇匀），按供试品溶液制备方法操作。照上述色谱条件，分别精密吸取10µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果良好，见附表1。

4 特征图谱的确定及特征峰的指认[7][8][9][10]

4.1 特征峰的指认 按上述色谱条件的方法，取10批样品内容物各1份，照供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取10µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图4。根据10批样品共有峰的情况比较，确定了4个特征峰，用对照品指认了其中的峰2、峰3、峰S分别为隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA。

4.2 特征图谱测定条件的考察

4.2.1 不同色谱柱的考察 分别用KromSiL、DiamonSiL、WondaSiL 三个品牌（规格同为C185µm，150mm×4.6mm）的色谱柱进行了比较，结果表明各色谱柱出峰顺序基本一致，各个色谱柱对各1～4（S）色谱峰分离效果均较好，但其他色谱峰分离度及保留时间均差异较大，故仅确定上述4个峰作为特征峰进行分析。计算特征峰相对保留时间的相对偏差，结果显示，特征峰1～4（S）RSD均小于3%，结果见附表2，故上述3 个品牌的150mm色谱柱均可用于特征图谱的测定。

附图 4 10批复方丹参片色谱图

附表1 加样回收试验

附表2 不同色谱柱相对保留时间

附表3 不同柱温条件下特征峰的相对保留时间

附表4 10批复方丹参片特征图谱共有峰相对保留时间

4.2.2 不同柱温的考察 分别采用不同的柱温进行了比较，结果表明不同温度条件下出峰顺序基本一致，对1～4（S）色谱峰分离效果均较好。计算特征峰相对保留时间的相对偏差，结果显示，特征峰1～4（S）RSD均小于2%，故25℃～35℃可用于特征图谱的测定。结果见附表3。

4.3 样品的测定 按上述色谱条件的方法，测定10批样品共有峰保留时间，并以丹参酮ⅡA（S）为参照峰，计算各峰的相对保留时间。结果见附表4。结果显示，不同批号样品之间共有峰相对保留时间RSD均小于1%。

4.4 各特征峰相对保留时间规定值的确定 综合上述不同条件下，以丹参酮ⅡA为参照峰，计算得到的相对保留时间，求取平均值作为规定值，分别为0.44（峰1）、0.60（峰2）、0.70（峰3），并且相对保留时间，均应在规定值的±5%范围内。

5 讨论

复方丹参片作为传统中药制剂，充分体现了中药复方多成分、多靶点的特点，因此对其含有各个成分也应有相应的质量控制。特征图谱及特征峰作为药品特别是中药的质量控制方法，操作简单，适用性强，可以用于定性和定量检测。