口蹄疫抗体快速检测卡的研制与应用

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(1.广东省出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东广州 510623；2.华南农业大学动物科学学院)

口蹄疫(FMD)是世界动物卫生组织(OIE)规定的通报性动物疫病，我国列为一类动物传染病。OIE最近通报了口蹄疫的发病状况，除O型持续流行外，还存在A型口蹄疫。牛、猪、山羊和绵羊均可能感染发病，因此对养殖业危害极大。我国主要采用ELISA、RT-PCR、血凝抑制试验(HIT)和病毒分离等方法进行检疫处理。

胶体金免疫层析分析(GICA)是一种适用于野外作业的新型口蹄疫抗体快速检测诊断技术，具有快速简便、结果可靠等特点[1-7]。本研究利用合成肽表面展示技术，进行口蹄疫抗体快速检测卡研制与应用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1合成肽重组复合体 设计合成肽基因HXT5[8-9]，经T4噬菌体表面展示构建合成肽重组复合体。

1.2血清和试剂 猪O型FMD、猪水泡病阳性和阴性血清，以及HIT检测试剂由农业部兰州兽医研究所提供。蓝耳病和猪瘟阳性血清由农业部哈尔滨兽医研究所提供。临床血清检测样品由广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存。鸡抗FMDV血清(一抗)和羊抗鸡IgG(二抗)由珠海某生物技术有限公司提供。

1.3胶体金制备和标记 将0.01%氯金酸100 mL加热，冷凝后用0.2 M K2CO3调pH值至6.0，置4℃冰箱保存备用。制备好的胶体金溶液与一定浓度的合成肽重组复合体偶联，制成检测卡，用塑料袋真空包装备用。

1.4结果判定和评价 将待检血清样品添加在样品垫，向吸水垫方向移动，经硝酸纤维素膜条层析，与标记膜(C、T)上的抗原反应，由胶体金浓缩显色。添加水泡病、蓝耳病和猪瘟阳性血清进行特异性评价，将FMD阳性血清倍比稀释进行敏感性测定，检测卡在室温保存一定时间观察稳定性。

2 结果与分析

2.1合成肽设计 设计O型FMDV RGD决定簇122个氨基酸序列(图1)，基因合成后用于T4噬菌体表面展示。

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图1 用于GICA测定口蹄疫抗体的合成肽氨基酸序列

2.2胶体金制备 蔗糖梯度离心获得重组噬菌体用于包被，采用正交方式优化配比，红色(图2：A)和黑色(图2：B)胶体金颗粒GICA测定口蹄疫抗体取得良好的显色效果(图2：T)，阴性血清不显色。

图2 不同颜色胶体金颗粒GICA测定口蹄疫抗体的显色效果

2.3评价试验 取研制检测卡，分别用猪水泡病、猪蓝耳病、猪瘟阳性血清进行检测，结果均未出现阳性信号，表明所研制的试剂盒特异性良好。

2.4半定量测定 阳性血清倍比稀释后检测灵敏度达到1∶512(图3:D)，与HIT检测结果相同。

图3 GICA测定口蹄疫抗体血清倍比稀释出现的颜色梯度反应

2.5田间样品检测 随机采集经O型合成肽疫苗和灭活疫苗接种的两猪群血清，应用检测卡测试，阳性率分别达85.7%和92.0%(表1)。

表1 GICA试纸条检测猪乙型脑炎抗体不同猪群检测结果

3 讨论

FMD具有急性高度接触性传染特点，可同时感染牛、羊、猪等偶蹄动物。目前流行O型和A型等不同血清型病毒，免疫接种是主要的防控措施。畜群FMD抗体水平越高，则免疫保护力越强[2]。因此，对抗体水平进行快速准确检测是免疫防控策略的重要组成部分。中和试验、ELISA、DIVA、HIF等常规的血清抗体检测方法，都需要一定的仪器设备和操作技能，检测时间较长，不能满足基层单位的应用需求。而GICA已在生物医学领域广泛应用，可显色肉眼判定结果，准确可靠；无需仪器，基层单位应用方便；常温运输和保存，有利于大规模推广应用。本研究采用新型GICA方法检测FMD抗体获得成功，值得推广应用。

FMD合成肽疫苗采用肽段叠加和添加载体构建复合物，生物活性显著增强[8]。本研究以噬菌体载体进行活性肽多拷贝表面展示，复合物在GICA中显示出类似全病毒的免疫活性。纯化的重组颗粒大小一致，与合适的胶体金颗粒吸附良好，稳定性高。用于体外诊断可以避免噬菌体载体本身对机体产生毒性和免疫抑制作用，与常规全病毒和原核表达抗原GICA比较，具有更好的生物安全性，成本更加低廉，绿色环保，无毒副作用。

FMDV具有VP1 G-H loop结构，包含病毒主要抗原位点，在合成肽疫苗中可诱导体液和细胞免疫[9]。本研究合成肽包含重要的O型FMDV RGD决定簇，表面展示复合体用于GICA检测FMD抗体，与猪瘟、猪水泡病、蓝耳病阳性血清无交叉反应，特异性良好，敏感性与正向间凝相当，用于半定量测定稳定性好，可重复性强。制备的试剂盒在FMD免疫检测和感染抗体快速检测中具有广泛应用前景。

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