小肠缺血性改变引起HCN-1、SP及CGRP表达变化的研究

章鹏宇，朱 琳，王景杰

第四军医大学唐都医院消化内科，陕西 西安 710038

超极化激活的环核苷酸门控通道(HCN)广泛表达于循环和神经系统，在心脏起搏、神经系统活动中发挥重要的作用;前期研究表明HCN1在大鼠胃电起搏区和回盲部的Cajal细胞上明确存在，并特异性存在于ICCs，可能是Cajal细胞重要离子通道的物质基础，与Cajal细胞的起搏作用有关;HCN2阳性细胞在成年小鼠胃肠道肌间神经丛成簇紧密排列，并与神经递质P物质、血管活性肠肽及降钙素基因相关肽共存，在调控胃肠神经活动、调节胃肠功能方面起着重要的作用[1-2]。我们的前期研究表明HCN-1在小肠黏膜和平滑肌间隙中存在，且其在胃肠道缺血状况下在小肠的表达明显增高，提示HCN-1可能与胃肠道的动力起搏或调解方面起着较为重要的作用[3]。而SP、CGRP作为参与胃肠活动调节的神经递质，在肠道中同HCN-1的作用是否相关，具有重要的研究意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组:Sprague-Dawley雄性大鼠15只，由第四军医大学实验动物中心提供，鼠龄12周，体质量(200±20)g，动物饲养温度控制在(20±2)℃，喂养常规鼠食和自来水，12 h黑暗光明周期。按照完全随机分组分成正常组、假手术组、小肠缺血改变组3组，每组5只。

1.1.2 实验方法:正常组大鼠取标本前正常饲养，小肠缺血改变组为手术设定在无菌条件下，10%乌拉坦腹腔麻醉(10 mL/kg)，通过大鼠腹部正中切口开腹，找到肠系膜上动脉，并用丝线不完全结扎，关腹继续饲养5 d，等待处死取材;假手术组只做单纯开腹，不做结扎，关腹后正常饲养5 d，等待处死取材。

1.1.3 实验仪器、试剂:超低温切片机(Leica公司)、激光共聚焦显微镜(Olympus公司)、兔抗大鼠HCN1多抗(Abcam公司)、羊抗大鼠CGRP多抗(Abcam公司)、鼠抗兔SP单抗(Abcam公司)。

1.2 取材与检测

1.2.1 标本固定与取材:电生理测定完成后处死大鼠，剖开左侧胸腔，拨开心包膜，暴露心脏。剪开右心耳放出血液，再剪开左心室将16号灌注针沿切口插入左心室至升主动脉根部用动脉夹固定，先输入100 mL生理盐水将血管内的血球冲干净，再注入多聚甲醛固定液灌流400 mL进行固定，调整滴速，缓慢滴注，流出清亮液体。待固定完全后，取肠系膜上动脉结扎后支配区域小肠，正常组及小肠缺血改变组取相同部位小肠，将所取小肠组织放置20%的蔗糖溶液中过夜沉底。

1.2.2 组织冰冻切片制作:取固定好的小肠组织用超低温切片机(Leica公司)切片10 μm，待染。

1.2.3 双重荧光免疫组织化学标记(间接法):将标本置于0.3%H2O2－甲醇中浸泡30 min封闭内源性过氧化物酶，0.1%Triton浸泡30 min，PBS漂洗，标本先后加入一抗，即免疫血清稀释的1∶50兔抗大鼠HCN1多抗、1∶50羊抗大鼠CGRP多抗，4℃孵育过夜(约14 h)，第2天将切片和铺片置于室温下复温1 h，经PBS漂洗后，先后加入1∶1000 FITC标记的驴抗羊IgG二抗及1∶1000 TexasRed标记的驴抗兔IgG二抗，室温孵育3 h，PBS漂洗后，将铺片平置于载玻片上，与切片标本同时用60%缓冲甘油封片。以上过程均需避光操作。同样过程标记HCN-1与SP。

1.2.4 激光共聚焦显微镜采图分析:每一张切片取4～6个视野，将数字化图像储存于LSCM系统的计算机，采用40倍视野观察HCN-1与SP、CGRP的分布及3个实验分组之间的变化情况。

1.3 统计学分析 对免疫荧光双标记图像进行Image J软件进行比较，结果用表示，并用SPSS ver.13.0进行完全随机随组方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验结果显示:正常状态下，HCN1与促胃肠动力的兴奋性递质SP和抑制性神经递质CGRP存在递质共存。然而，因小肠缺血性改变可以导致这种共存递质的SP和CGRP反应水平提高，而HCN1的水平与SP及CGRP的情况相反，其表达水平仍较正常组和假手术组为低:即正常组和假手术组大鼠的SP荧光光度值OD为54±5和57±5，与之双标的HCN1荧光光度值OD为73±5;正常组和假手术组大鼠的CGRP荧光光度值OD为72±5和75±5，与之双标的HCN1荧光光度值OD为73±5，两组间SP的表达未见显著性差异，但均较缺血改变模型的表达低(P＜0.05);小肠缺血组的荧光光度值变化为:SP荧光光度值OD为125±5;CGRP荧光光度值OD为167±5;HCN1荧光光度值OD为46±5。差异有统计学意义(P＜0.05，见图1～4)。

3 讨论

SP和CGRP是重要的胃肠肽。SP可以兴奋神经，唤醒行为应答，是强有力的血管扩张剂，与许多平滑肌相关;CGRP在甲状腺C细胞以及中枢神经、外周神经中表达，是强有力的血管扩张剂，并且可以影响心跳强度与频率，它可以调节神经肌肉接头处乙酰胆碱受体的功能，可以阻断吗啡的耐受性，可以调节皮肤朗格汉斯细胞的抗原提呈[4-11]。

我们的前期研究中，通过对缺血大鼠小肠的HCN-1与C-kit免疫荧光双标记的检测，可见HCN-1与C-kit阳性表达在小肠黏膜和平滑肌间隙，并且缺血改变后两者表达明显增高，提示HCN-1代偿性引起细胞兴奋性的增高，说明ICCs的HCN-1通道在调节胃肠动力方面有重要作用。

本研究发现，无论是正常组还是对照组，以及模型实验组均存在着HCN1和兴奋性递质SP以及抑制性递质CGRP共存的现象。这一现象提示，HCN1作为离子通道，其活动变化是受神经递质调控的，这也符合离子通道的特性。与此同时，我们还发现，造模组的脑肠肽SP和CGRP的表达水平较正常组和假手术组高，而HCN1的表达水平却较其为低。这一现象提示，当胃肠道功能产生障碍的情况下，兴奋性促胃肠动力的调节递质在其中可能发挥着主要的作用，而抑制性递质也会随着兴奋性递质的作用以及胃肠动力障碍的产生而发生水平上调。虽然胃肠道缺血性改变可使离子通道的激活状态仍处于低活化状态，但是，随着侧支循环的建立以及调节递质的不断作用，胃肠道动力的恢复会逐渐产生。综上所述，离子通道HCN-1在大鼠小肠缺血改变后，在侧支循环的不断建立下，由于兴奋性递质的调控作用，产生障碍的胃肠动力将逐渐得到恢复。同时，抑制性递质也在其中发挥了重要的作用，使胃肠道动力的恢复过程呈现出时效性变化。但是，无论是兴奋性递质还是抑制性递质，都将通过离子通道HCN1发挥作用。所以，进一步提示说明HCN-1作为“始发”离子通道在胃肠道动力起搏上可能发挥重要作用，为调节胃肠功能的研究提供新的想法，并提示胃肠功能调整的新思路。

图4 小肠缺血性改变对HCN1和CGRP表达的影响 A:正常组;B:假手术组;C:小肠缺血性改变组(Bar=100 μm)Fig4 Expressions of HCN1 and CGRP after ischemia injury of small intestine

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