黄芪对喉癌细胞增殖和凋亡的影响

宋 岩，刘秀萍，白伟良，季文樾

随着分子生物学、细胞生物学、肿瘤学等相关生命学科的迅猛发展，喉癌的化疗药物研究也进入了一个新阶段［1］。近年来国内外研究表明，清热类中药黄芪可通过调节花生四烯酸系统的代谢，诱导肿瘤细胞周期停滞及细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管生成，抗肿瘤侵袭和转移，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等发挥其抗肿瘤作用［2］。文献报道其在膀胱癌、胃癌治疗方面作用显著，但在喉癌治疗中的研究甚少，本文就黄芪对喉癌细胞增殖和凋亡的影响进行了研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 细胞株:喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株购自中国科学院细胞库。试剂:黄芪注射液购自正大青春宝集团;Annexin V凋亡检测试剂盒购自凯基公司;MTT、碘化丙啶(Proidum iodide，PI)、二甲基亚枫(DimethyI sulfoxide，DMSO)等购自北京鼎国生物公司;TMPI-1640培养液购于美国Gibco公司;RnaseA购于碧云天;标准胎牛血清购自杭州四季青公司;青链霉素、磷酸盐缓冲溶液(Phophate buffered saline，PBS)购自上海生工生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 喉鳞状细胞癌Hep-2细胞用含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基培养，加100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素37℃，5%CO2饱和湿度培养，48 h传一代，取对数生长期用于实验。

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期Hep-2细胞，常规胰酶消化，调节细胞浓度为1×105个/L，接种于96孔板，贴壁24 h后，换成含有不同浓度黄芪(20、100、200 μg/mL)的培养液，每组3个复孔，作用24 h后，加入MTT，继续培养4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，待紫色结晶完全溶解后，用酶标试仪测定490 nm处吸光度(A)值绘制生长曲线，观察药物抑制细胞生长情况。细胞增殖抑制率=(1-加药孔细胞A值/对照孔细胞A值)×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 将适当浓度的对数生长期Hep-2细胞接种于100 mL培养瓶中，培养24 h，吸出培养基，加入含有不同浓度黄芪(20、100、200 μg/mL)的培养液，分别作用24 h，收集 1×106个细胞，1 000 r/min离心10 min，PBS洗1次，4℃、75%冰乙醇固定24 h，PBS洗3次，上机前加入PI冰浴避光放置1 h，调整细胞浓度到1×106个/L，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，如此重复3次。

1.2.4 细胞形态学观察 取对数生长期细胞，每瓶4×105接种于25 mL培养瓶中，置37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养过夜，待细胞贴壁后，按“1.2.3”项方法分组处理各组细胞，继续孵育培养24 h后，应用光学倒置显微镜观察细胞生长形态，并随机拍照。

1.2.5 Hoechst 33258染色观察细胞核形态变化将预处理过的盖玻片置于6孔板内，Hep-2细胞密度调整为5×105/mL，各取1 mL种入6孔板培养过夜，使细胞长至60%～80%。给药组加入200 μg/mL的黄芪培养液培养24 h，吸尽培养液，加入固定液0.5 mL固定15 min，PBS洗2次，加1 mL Hoechst 33258荧光染液，避光10 min，封片后荧光显微镜观察，照相，见图1。

图1 Hoechst 33258荧光染色法观察黄芪作用前后细胞形态学变化

1.3 统计学分析 采用Excel统计数据，SPSS 12.0统计软件分析。数据用表示，两组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT检测黄芪对Hep-2细胞生长的抑制作用 通过绘制细胞生长曲线发现，黄芪可抑制Hep-2细胞生长，并且随着药物浓度增加其生长抑制率也增加，两者存在浓度相关性。见表1。

表1 不同浓度黄芪作用24 h后抑制率、凋亡率比较(%)

2.2 黄芪对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测发现，黄芪具有诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用，细胞凋亡发生率随黄芪浓度增加而明显增加。结果见表2。

表2 不同浓度黄芪作用24 h后细胞各周期分布(%)

2.3 光镜观察 由倒置相差显微镜可以观察到，与未经处理的对照组相比，干预组都有不同程度的形态改变，见图2。

2.4 Hoechst 33258染色荧光显微镜观察 200 μg/mL黄芪作用于Hep-2细胞24 h后，细胞发生显著性形态学改变，出现大量染色质边聚，细胞核固缩，甚至可见核碎裂、核溶解特征性表现。凋亡的细胞随着黄芪浓度的增加明显增多，最后大片细胞脱落，可观察到细胞脱失区，结果见图2。

图2 光镜下观察黄芪作用前后Hep-2细胞形态学变化

3 讨论

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，在中国东北发病率较高，近年来发病率在世界范围内也呈上升趋势。目前，在放化疗和外科手术联合治疗的情况下，Tis、T1及T2期喉癌治疗有效率为80%～90%，而T3、T4期喉癌只有40%～50%。尽管外科手术和放化疗技术有了明显进步，但患者的5年生存率仍没有提高，原因是多方面的，其中对发病机制研究不够完善、没有明确的治疗靶点是最关键的原因。

本研究表明，黄芪具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。MTT检测结果表明，黄芪可抑制Hep-2细胞，且随着药物浓度增加其生长抑制率也增加，两者存在浓度依赖关系。浓度为20、100、200 μg/mL时，抑瘤率分别为35.38% ±0.17%、59.12% ±0.21%、84.55% ±0.27%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。抑制率随浓度增加而逐渐上升，到 200 μg/mL时，其抑制率达84.55% ±0.27%，抑瘤作用显著，由此推断黄芪可以在体内外发挥对喉癌的抑制作用。笔者用流式细胞仪检测不同浓度黄芪作用Hep-2细胞后引起的细胞凋亡率的变化，发现20 μg/mL时凋亡率为38.2% ±1.3%，100 μg/mL时凋亡率为 87.2% ±1.7%，200 μg/mL浓度时凋亡率为94.6% ±1.3%，与对照组相比，差异有统计学意义，并呈现明显的剂量依赖性，说明黄芪可有效促进喉癌Hep-2细胞凋亡。

笔者采用光镜与免疫荧光染色对给药前后喉癌Hep-2细胞进行微观对比，发现光镜下黄芪作用细胞24 h后，随着黄芪浓度的增加，细胞变圆，不规则，细胞数目明显减少，细胞间隙变大;荧光染色下，细胞出现核碎裂，核仁消失，染色质固缩，可见凋亡细胞，严重时成片细胞脱落。对照组喉癌Hep-2细胞生长良好，细胞形态圆，胞膜表面光滑，无凋亡发生。

黄芪为多年生草本植物，主要成分为黄酮，如黄芪素。研究发现，黄芪素可下调bcl-2表达，上调Bax表达，通过细胞色素C-线粒体-Caspase-3途径诱导乳腺癌细胞凋亡［3］。Roy等［4］发现，小剂量黄芪素(10或20 mol/L)使人白血病HL-60细胞大量停滞于S或G2/M期，而大剂量黄芪素则诱导细胞凋亡。黄芪具有诱导多种肿瘤细胞凋亡、影响细胞周期、抑制肿瘤侵袭转移等特点，但其抗肿瘤机制复杂多样，尚未完全明确［5］。笔者用不同浓度的黄芪进行体外抑癌实验，应用不同方式检测不同浓度黄芪对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的促凋亡作用，发现黄芪体外作用人喉癌Hep-2细胞后，可抑制肿瘤细胞生长，促进其凋亡以达到抗癌作用，但具体机制有待进一步研究。

［1］Tsai YS，Lee KW，Huang JL，et al.Arecoline，a major alkaloid of areca nut，inhibits p53，represses DNA repair，and triggers DNA damage response in human epithelial cells［J］.Toxicology，2008，249(2-3):230-237.

［2］毛捷，徐善水，盛莉莉，等.黄芪素的抗肿瘤作用及机制的研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2009，14(10):1178-1182.

［3］Lee JH，Li YC，Ip SW，et al.The role of Ca2+in baicalein induced apoptosis in human breast MDA-MB-231 cancer cells through mitochondria and caspase-3-dependent pathway［J］.Anticancer Res，2007，27(1A):117-125.

［4］Roy MK，Nakahara K，Na TV，et al.Baicalein，a flavonoid extracted from a methanolic extract of Oroxylum indicum inhibits proliferation of a cancer cell line in vitro via induction of apoptosis［J］.Pharmazie，2007，62(2):149-153.

［5］王晓瑜，龙汉安.黄芪及黄酮类成分防治肿瘤作用的研究进展［J］.华西医学，2011，26(2):297-300.