野生大豆GsRNF12 基因的克隆及表达载体的构建

张红梅 ，白云 ，2，魏贤斌 ，邓馨 ，肖莉杰 ，费志宏 ，方淑梅 ，韩毅强 ，王北艳

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.大庆市质量技术监督局标准化所；3.黑龙江省八五三农场；4.中国科学院植物研究所；5.黑龙江八一农垦大学农学院）

中国野生大豆遗传资源数量多、类型丰富，受到世界大豆主产国高度重视。野生大豆具有极强的抗逆性和丰富的遗传多样性，为栽培大豆的亲缘较近的野生种，它是大豆育种极为重要的种质资源[1-2]。野生大豆资源研究开发利用，对拓宽栽培大豆的遗传基础，提高大豆育种水平具有重要价值。

大豆GmRNF12 基因属于锌指蛋白家族基因，对高盐、低温、金属胁迫具有较强的抗性[3]。但研究者对野生大豆的锌指蛋白家族基因研究较少。利用RT-PCR 技术扩增野生大豆GsRNF12 基因，并对基因编码的氨基酸进行序列比对分析，并构建了该基因的植物表达载体，为进一步研究该基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

野生大豆材料由实验室收集。pGM-T vector 购自天根生化科技（北京）有限公司，大肠杆菌DH5α由实验室保存。

限制性内切酶、LA Taq 酶、T4-DNA 连接酶、RNA 提取试剂（RNAiso Reagent）、M-MLV 反转录酶（RNase H-）、引物 Oligo（dT）、2.5 mMdNTP、RNA 酶抑制剂、Protein Molecular Weight Marker（Low）、胶回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由北京全式金生物公司合成，测序由上海生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成

利用TRIzol 试剂盒提取野生大豆叶片的总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA 第一链。

1.2.2 PCR 扩增

野生大豆与栽培大豆亲缘关系较近，因此根据GenBank 登录的栽培大豆的RNF12 基因全长设计特异引物，并在上下游引物的5′、3′端分别加AgeⅠ和ECORⅠ酶切位点序列，引物序列为：

5′-ACCGGTatgacgagcgcttcggagc-3′；

5′-C CGGAATTCttagttaattacaactatac-3′

在 25 μL 的反应体系中，dNTP 1 μL，上、下游引物各 1 μL ，模板 cDNA 1 μL，LA Taq 酶 0.5 μL，10 倍 buffer 2.5 μL（含 Mg2+），以 ddH2O 补至 25 μL。PCR 扩增条件为：94℃预变性3 min，94℃变性50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃延伸 1 min，36 cycles，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 目的片段克隆、测序分析

将 PCR 产物回收后，按 3∶1 比例与克体pMD18-T 连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，经PCR 及酶切鉴定含有阳性重组质粒的菌株送上海生物工程公司测序。将测序结果经 BLAST 比对，采用NCBI 的ORFfinder 确定该基因的开放阅读框，氨基酸多序列比对用DNAman 软件完成。

1.2.4 野大豆GsRNF12 基因的植物表达载体的构建

将重组质粒 pMDGsRNF12 和pEGAD 分别用AgeⅠ和ECORⅠ双酶切，回收目的片段和载体大片段，经T4 DNA 连接酶16℃过夜连接，连接产物转化DH5A 感受态细胞，在LB 培养基（含有10 μg ·mL-1的卡那霉素）上筛选重组子。挑取阳性克隆，经PCR检测和酶切鉴定验证重组质粒，命名为pEGADGsRNF12。

2 结果与分析

2.1 GsRNF12 基因 cDNA 序列的扩增及pMD GsRNF12 重组质粒PCR、酶切鉴定结果

根据大豆GmRNF12 基因ORF 序列设计特异引物，以野生大豆cDNA 为模板进行PCR 扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，大约在720 bp处出现特异性条带（图1），与克隆载体连接后，经AgeⅠ和ECORⅠ双酶切、PCR 鉴定后，与预期结果大小基本一致。测序结果表明，所得序列长度为723 bp，命名为 GsRNF12。

图1 质粒pMD-GsRNF12 的PCR 及酶切鉴定Fig.1 PCR amplication and restriction analysis of pMD-GsRNF12 plasmid

2.2 GsRNF12 基因生物信息学分析

图2 GsRNF12 ORF 序列及其所编码的氨基酸序列Fig.2 ORF nucleotide sequence and putative amino acid sequence of GsRNF12

野大豆基因GsRNF12 的cDNA 序列包含1 个完整的开放阅读框（1～723 bp），对GsRNF12 基因编码蛋白的结构进行分析，编码239 个氨基酸中（图2），预测其等电点为6.23，该蛋白理论分子量为26.807 kDa。利用NCBI 对氨基酸进行保守区域分析，GsRNF12 在178-220 氨基酸处有典型的C4HC3 结构域，属于C3HC4 锌指蛋白家族，利用PSORT 软件分析GsRNF12 蛋白存在细胞核中。利用DNAman 软件对野大豆、栽培大豆、苜蓿的RNF12 氨基酸序列进行分析，发现该基因的氨基酸序列与大豆、苜蓿同源性>80%。

2.3 GsRNF12 基因植物表达载体的构建

目的片段与表达载体连接、转化后，对筛选出的阳性克隆进行PCR 和AgeⅠ、ECORⅠ双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测到约730 的目的带（图3），结果表明该片段大小正确，说明目的片段插入的位置和方向正确，成功构建出了植物表达载体pEGAD-GsRNF12。（图 4）。

图3 植物表达载体pEGAD-GsRNF12 酶切、PCR 切鉴定Fig.3 Identification of pEGAD-GsRNF12 plant express ion vector by PCR amplification and enzyme digestion

图4 植物表达载体pEGAD-GsRNF12 的鉴定Fig.4 Identification of plant expression vector pEGAD-GsRNF12

3 讨论

锌指蛋白在真核生物基因组中十分丰富，根据半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基的数目和位置，将锌指结构分为 C2C2、C2H2、C3 H 2C3、C3 HC4（RI NG finger）4 个亚类[5]。针对非生物逆境的胁迫，通过一系列逆境信号分子，植物形成了非常复杂而完善的调控网络，锌指蛋白基因家族在此调控网络中，发挥着非常重要的调节作用[6]。许多研究表明，锌指蛋白在调节植物防卫基因表达和抗逆性起关键作用。研究利用优化的PCR 反应体系和反应，我们克隆到了野生大豆锌指蛋白命名为GsRNF12 基因cDNA 全长，属于C3HC4 型锌指蛋白基因。构建了该基因的植物表达载体，为下一步研究该基因功能奠定了基础。

［1］ 张春宝，赵洪锟，李启云.野生大豆-吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）基因的克隆与序列分析［J］.大豆科学，2008，27（6）：915-920.

［2］ 王丹阳，吴铭.对黑龙江省野大豆保护与利用的研究［J］.林业勘察设计，2011（1）：85-86.

［3］ 张红梅.铝胁迫下大豆差异基因表达及GmRNF12、GmFDR3 基因功能分析［D］.长春：吉林大学，2011.

［4］ 韩毅强，张云超，张红梅.NaCl 胁迫对大豆种子萌发及其生理变化的影响［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（4）：11-14.

［5］ 刘强，张贵友，陈受宜.植物转录因子的结构与调控作用［J］.科学通报，2000，45（14）：1465-1474.

［6］ Mukhopadhyay A，Vij S，Tyagi A K.Overexpression of a znic finger protein gene from rice confers tolerance to cold，dehydration and salt stress in transgenic tobacco［J］.PNAS ，2004，101（16）：6309-6314.