翘嘴鳜淀粉酶基因SNPs和微卫星位点多态性的检测

彭敏燕， 梁旭方， 方 荣， 于海静， 朱 滔

(暨南大学生命科学技术学院生物工程学系，广东广州510632)

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)隶属于鲈形目(Perciformes)、暖鲈科(Percichthyidae)、鳜属，俗称桂鱼、桂花鱼、胖鳜、季花鱼等，是淡水底栖的肉食性鱼类.它具有体型大，生长快，味道鲜美等特点，深受国内外消费者喜爱，有“淡水石斑鱼”之称.目前，人工养殖的鳜鱼主要是翘嘴鳜和大眼鳜，翘嘴鳜养殖规模不断扩大，已经成为我国重要的名贵经济鱼类，因而具有很大商业养殖价值［1］.淀粉酶(amylase，AMY)是一种消化酶，主要分布在翘嘴鳜的肠道和胰脏中［2］，它能水解食物中的淀粉形成二糖和三糖，再由其他酶转化成能量以供鱼类生长代谢［3］.不过鱼类本身分泌的AMY等消化酶还不能够满足其快速生长发育的需要，养殖中需要在饲料中额外添加适量外源酶来弥补内源酶的不足，以提高饲料的利用率并促进鱼类生长［4］.因此，从分子水平上对AMY基因进行研究，对促进水产养殖业中翘嘴鳜的生长发育具有重要的意义.

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是广泛存在于基因组中的一类由单个碱基转换或颠换引起的 DNA序列变异，除了密度高、遗传稳定的特点外，更重要的是某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平［5］.微卫星 (microsatellite)又称简单序列重复(simplesequencerepeats，SSR)，是指以少数几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的简单多次串联重复序列，广泛存在于各类真核基因组中，它具有多态性高、结果稳定可靠等特点.因此，它和SNP标记都是十分理想的分子标记，在遗传图谱构建、数量性状位点(QTL)定位、标记辅助选择、遗传多样性评估等领域都有着重要的应用价值［6］.例如 Dickey等［7］发现果蝇AMY调控基因的多态性位点影响了果蝇淀粉酶的分泌水平;猪ATF4基因的SNP位点A159G对臀部膘厚有极显著影响［8］.此外，吕伟华等［9］采用23对微卫星分别标记了鲤鱼的体长、体高、体厚和体质量4种经济性状;林琳等［10］在中国人群中对妊高症相关基因eNOS内含子13进行了微卫星标记.目前，国内外有关养殖业动物AMY基因多态性位点检测的报道中，常见的有家畜、贝类、甲壳类以及一些经济鱼类等［11－13］，而关于翘嘴鳜AMY基因SNP及微卫星多态性位点检测的研究则尚未见报道.因此，本研究试图初步对影响生长发育有的AMY进行SNP和微卫星多态性位点的检测，为后期进行翘嘴鳜的分子遗传育种提供理论依据.实验首先对翘嘴鳜AMY基因组序列进行DNA测序，初步检测出SNPs和微卫星多态性位点，并通过CRS-PCR和PCR-DS法对SNPs位点进行验证和分型，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测微卫星多态性.以期为今后研究翘嘴鳜AMY基因的结构和功能提供分子标记，以及从分子水平上为后期探索AMY基因的多态性与翘嘴鳜生长发育的关系奠定其理论基础，有利于加快翘嘴鳜遗传选育进程.

1 材料与方法

1.1 材料

(1)实验材料 翘嘴鳜购于广东佛山新荣鱼苗繁殖场，全部系人工繁育苗种，其亲鱼均源自长江水系，实验用鱼共166尾.以鲮鱼苗作为饵料鱼，大小要适口.

(2)主要试剂 TIANGEN DNA提取试剂盒为合达公司(广州)产品，TaqTM DNA聚合酶和限制性内切酶为宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)产品，其他试剂均为进口分装或者国产分析纯试剂.

(3)引物设计及合成 根据本实验室提供的鳜鱼AMY基因组序列(GenBank登陆号:EU9028272)，用软件Primer Premier 5和Primer 1.0综合分析，设计5对引物(P1-P5)用于翘嘴鳜AMY基因SNPs位点的检测.引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物信息如表1.

表1 翘嘴鳜AMY基因各引物信息Table 1 Primers information of AMY gene in Siniperca chuatsi s

1.2 方法

(1)基因组DNA提取 获取实验鱼的鳍条组织，按TIANGEN DNA提取试剂盒推荐方法提取基因组DNA.

(2)PCR扩增和产物纯化测序 随机选取翘嘴鳜DNA模板20个，分别用5对引物(P1－P5)进行PCR扩增，PCR反应体系:10×buffer缓冲液2.5 μL，dNTP 2 μL，rTaq 酶 0.125 μL，模板 1 μL，引物各加 0.5 μL，最后补充双蒸水(ddH2O)至 25 μL.PCR扩增条件为:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，根据不同引物的退火温度进行退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃下延伸5 min.PCR产物纯化及测序由上海英骏生物技术有限公司完成.

(3)SNPs位点的筛选和分型 应用序列分析软件Clustal X，DNAStar和Chromas综合分析测序结果，筛选出AMY基因中的SNP位点，然后采用CRSPCR法对部分SNP位点进行分型［14］.使用在线错配引物设计软件 dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计错配引物 P6(见表1)，然后使用引物P6扩增PCR产物，使产物中的SNP位点A1可被TaqI酶切.酶切体系:TaqI 0.5 μL，BSA 1.0 μL，Buffer 1.0 μL，PCR 产物 0.4 μL，最后补充双蒸水至10 μL.酶切产物使用质量分数12%的聚丙烯酰胺凝胶(VAcr∶VBis=29∶1)进行电泳，120 V电压电泳4 h后银染显色.另外，对不能使用CRS-PCR法的SNPs位点 A2、A3和 A4采用 PCRDS法进行分型.

(4)微卫星位点的检测及分型 使用SSRHunter 1.03搜索鳜鱼AMY基因组的微卫星序列，并设计特异引物P7(见表1).扩增后的PCR产物在质量分数12%的聚丙烯酰胺凝胶中用120 V电压电泳4 h，银染显色.

(5)数据统计 统计各SNPs和微卫星位点的基因型，采用遗传多样性分析软件(PopGene 32)和多态信息含量计算软件(PIC-Calc 0.6)计算翘嘴鳜的遗传多样性指标.

2 结果与分析

2.1 翘嘴鳜AMY基因SNPs位点的测序及酶切结果

对翘嘴鳜AMY基因P1-P5的PCR产物测序结果进行分析，结果发现4个SNPs位点.在第1内含子发现了一个C/G的突变位点A1;在第5内含子处发现了3个 SNPs位点，分别命名为 A2、A3和A4.A2位点发生了T/A突变，A3发生了A/T突变，A4发生了G/C突变.

图1 翘嘴鳜AMY基因A1、A2、A3和A4 4个SNPs位点的测序峰图(箭头表示突变发生的位置)Fig.1 Sequencing pictures of four SNPs A1，A2，A3 and A4 of AMY gene in Siniperca chuatsi(Arrows show the positions of variation)

图2 翘嘴鳜AMY基因SNP位点A1酶切电泳图Fig.2 CRS-PCR picture of SNP locus A1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

采用CRS-PCR方法对A1位点分型，结果共检测到3种基因型，分别为 GG(205 bp、21 bp)、GC(226 bp、205 bp、21 bp)和 CC(226 bp)，21 bp 的电泳带太小没有在电泳图中显示出来，A1测序峰图和酶切图分别见图1和图2.由于A2、A3和A4 3个SNPs位点两边的序列不适合设计酶切引物，因此无法采用酶切的方法进行分型，实验将部分模板使用PCR-DS法分型.测序结果发现A2位点有两种基因型，分别为AT和TT;A3位点有3种基因型，分别为AA、AT和TT;A4位点也有3种基因型，分别是AA、AG和GG.这3个SNPs位点的测序结果如图1.

2.2 翘嘴鳜AMY基因SNPs位点的基因频率、基因型频率及遗传多态信息分析

统计翘嘴鳜AMY基因4个SNPs位点的基因型和基因频率，详见表2.卡方分析表明，4个SNPs位点P值均大于0.05，说明基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡.当PIC＞0.5为高度多态性，0.25＜PIC＜0.5为中度多态性，PIC＜0.25为低度多态性.由表2可知，AMY基因的4个SNPs位点均为中度多态性.各位点的有效等位基因数与等位基因的绝对值接近，说明等位基因在两个群体中的分布均匀;且杂合度为0.345 7－0.492 0，显示了较好的遗传多态性.

表2 翘嘴鳜AMY基因4个SNPs位点的遗传多态信息Table 2 Genetic information of four SNPs locus of AMY gene in Siniperca chuatsi

2.3 翘嘴鳜AMY基因微卫星位点B1的分型与遗传多态性分析

从翘嘴鳜AMY基因组序列第5内含子中检测到一个重复序列为(TTA)18(TAA)18的微卫星座位B1，将该位点通过PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果呈多态性(如图3).结合微卫星位点B1的测序结果分析发现有4个等位基因，微卫星等位基因大小分别为 96、99、102、105 bp，共组成 9 种单倍型.由表3可知，在翘嘴鳜群体中B1位点的杂合度为0.705 5，且多态信息含量大于0.5，说明翘嘴鳜两个群体遗传多样性非常丰富，具有高度多态性.

图3 翘嘴鳜AMY基因微卫星位点B1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.3 PAGE picture of SSR locus B1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

表3 翘嘴鳜AMY基因微卫星位点B1在翘嘴鳜群体中的遗传多态信息Table 3 Genetic information of SSR locus B1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

3 讨论

AMY在许多水生动物中控制着碳水化合物的代谢，并且是影响身体生长的主要因素之一［15］，因此本实验选择AMY基因作为候选基因进行研究，寻找可能影响翘嘴鳜生长的多态性位点.实验结果发现翘嘴鳜AMY基因具有两种分子标记，其中包括4个SNPs位点和一个微卫星位点.SNPs位点中除了A2只有两种基因型外，其余3个SNPs位点均为3种基因型，而微卫星位点的基因型B1多达9种.由此可见AMY基因的多态性位点数量丰富.

衡量一个群体的遗传多态性一般是通过计算其多态信息含量和各位点的平均杂合度来实现的［16］.多态信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多态性的指标.当PIC≥0.5时，为高度多态性;当0.25≤PIC＜0.5时，为中度多态性;当PIC＜0.5时，为低度多态性.在翘嘴鳜群体中，AMY基因4个SNPs位点的PIC值为0.284 3－0.371 4，为中度多态性;而微卫星位点B1在翘嘴鳜群体中的PIC值是0.650 4，属于高度多态性.在一个群体中，多态信息含量越大，表明该位点杂合子比例越大，提供的遗传信息越多.群体的杂合度(H)反映了被检测位点上群体的杂合子的频率，是群体遗传变异的一个最适参数，杂合度越高，群体的遗传多样性越丰富.从表中2和表3的杂合度数值可以看出，翘嘴鳜 AMY基因的4个SNPs位点均呈中度遗传多样性，而微卫星位点B1具有高度的群体多样性，群体遗传结构良好.有效等位基因数(Ne)是基因纯合度的倒数，是反映群体遗传变异大小的一个指标，其数值越接近所检测到的等位基因的绝对值，说明等位基因在群体中的分布越均匀［17］.由实验结果可知，翘嘴鳜AMY基因4个SNPs位点和微卫星位点的有效等位基因数均接近等位基因的绝对值，表明各等位基因均匀分布于翘嘴鳜群体中.

翘嘴鳜AMY基因中共检测到4个SNPs和一个微卫星位点，各多态位点在群体中表现出了丰富的遗传多态性.因此，本研究的5个多态性分子标记为后期研究翘嘴鳜的生长发育提供了理论基础，对加速翘嘴鳜分子标记辅助育种的进程具有重要意义.

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