胃癌组织的表面增强拉曼光谱研究*

巩龙静，马 君＊＊，周涵婧，刘 澍，周正华，毛伟征，郑荣儿

（1.中国海洋大学光学光电子实验室，山东 青岛266100；2.青岛大学医学院附属青岛市立医院普外科，山东 青岛266071）

胃癌在我国发病率居各类肿瘤之首，目前其诊断方法主要有X射线、胃镜、超声等，以病理检验为准，大都耗时、有创，寻找新的诊断方法仍是临床研究的重要课题。光谱诊断恶性肿瘤具有实时、无创的特点，是物理学与医学结合探索肿瘤诊断的热点问题。

拉曼光谱是物质固有的分子振动光谱，它反映了分子的结构信息。研究表明，组织在癌变后，其核酸、蛋白质、类胡萝卜素、脂类等物质的含量及结构会发生变化，这些变化会相应的反映在拉曼光谱上，拉曼光谱能从分子水平上鉴别癌。但因拉曼散射截面很小，组织常规拉曼信号较弱，易被强荧光背景湮没。基于粗糙表面的表面增强拉曼光谱（Surface－Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）技术可使拉曼信号提高十几个数量级，在适当条件下，SERS可以检测到单分子水平，具有很高的检测灵敏度［1－2］。相比普通拉曼光谱，金属团簇会淬灭簇拥分子的荧光，使拉曼光谱的信噪比大大提高，且它对生物分子没有损伤，非常适合生物医学研究。刘燕楠小组［3］利用银溶胶对肺癌及正常组织进行了SERS探测，对比分析了两者的特点与差异；S.CIntǎPInzaru等［4］发现结肠癌上皮组织的SERS主要来自DNA或RNA碱基的拉曼信号；陈荣小组［5－6］先后对鼻咽癌和甲状腺癌组织进行了SERS研究。胃癌组织的SERS探测尚未见报道。

本文在自体荧光光谱和拉曼光谱识别胃癌研究工作［7－8］的基础上，以金溶胶为基底，对胃癌及正常组织、组织匀浆和上清进行SERS探测和分析，以期寻找快速、无创诊断胃癌的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料的制备

标本来源及制备 选择2010年手术治疗的胃癌病人21例，男14例，女7例，平均年龄63.4岁。剪开切除的胃组织，胃癌组织取自肉眼胃癌最明显处，正常组织取自癌旁6cm以上不含癌的正常胃壁，每处1×2cm2；分成3块，行病理检查确诊，用于光谱测量，按100g／L制成组织匀浆，匀浆1 000r／min离心20min，取上层清液得组织匀浆上清液（以下简称上清）。

试剂来源 制备金溶胶的药品氯金酸和柠檬酸钠产于国药集团化学试剂有限公司，为分析纯；D－葡萄糖（glucose，Glu）和L－苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）产于国药集团化学试剂有限公司，L－酪氨酸（tyrosine，Tyr）产于天津市博迪化工有限公司，胆固醇（cholesterol，Cho）产于天津市大茂化学试剂厂，L－色氨酸（tryptophane，Trp）产于上海丽珠东风生物技术有限公司，小牛胸腺DNA产于美国SIGMA公司，型号为D－1501。实验用水为去离子水。

金溶胶制备 利用传统的柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备金溶胶［9］，具体步骤如下：30mL浓度为2×10－3mol／L的氯金酸水溶液放置磁力搅拌器上加热到沸腾，搅拌下缓慢加入10mL浓度为5.4×10－3mol／L的柠檬酸钠水溶液，沸腾状态下继续搅拌1h，室温下冷却。图1为金溶胶的扫描电镜图像及消光光谱（左上角），金纳米颗粒的平均直径约为58nm，吸收峰在534nm，近红外区的吸收较高，适于近红外激发光的拉曼探测。

图1 金溶胶的扫描电镜图像及消光光谱Fig.1 The SEM and extinction spectrum of pure Au colloids

1.2 拉曼光谱系统及探测

本文选用785nm连续激光作为激发光，经Y型光纤探头传入样品表面，照射到样品表面的光功率为25mW。后向散射光经收集光纤耦合进入QE65000型光谱仪（美国Ocean Optics公司），光谱仪分辨率为6cm－1，扫描范围0～2 000cm－1，积分时间均取30s，由 Ocean－Optics自带软件进行光谱记录。光谱实验均在暗室中进行。实验中利用DH－2000－VIS校准灯（美国Ocean Optics公司）对光谱数据进行强度校准。

将组织标本放在石英片上行拉曼光谱探测后，放入盛0.5mL金溶胶的比色皿中，探测组织表面3～5处不同点的SERS；分别探测组织匀浆和上清的拉曼光谱及其与金溶胶混合的SERS。每组测量3次取平均。

图2 SERS的增强效果图Fig.2 The enhancemant effect of SERS

2 实验结果

图2a－c是组织、匀浆和上清的SERS，d－f为组织、上清和金溶胶的拉曼光谱。结果显示：组织在1 002、1 449和1 653cm－1存在很弱的拉曼峰，加入金溶胶后，组织、匀浆和上清的拉曼信号均有明显增强，在623、656、724、828、963、1 032、1 087、1 128、1 244、1 329、1 367、1 471、1 597和1 723cm－1出现新的拉曼峰，在1 002cm－1处的拉曼信号变化不大，但在1 449和1 653cm－1处的信号被湮没，这可能是由于金溶胶对不同物质的吸附性不同引起的；金溶胶对组织、匀浆及上清拉曼信号的增强效果依次增大，特别在1 087与1 128cm－1处的强度比I1087／I1128分别为0.69、1.83和2.06。金溶胶的拉曼信号较弱，不会对探测结果产生干扰。

考虑生物组织的拉曼光谱的主要集中范围及光谱仪响应范围，选取400～1 800cm－1范围光谱进行分析。利用光谱仪所测得的标准灯的曲线与给定的标准曲线对每条光谱强度校准后，进行去背景处理，以消除光谱仪的响应效率、噪声、荧光背景等对光谱的影响。

2.1 组织、匀浆和上清的SERS

图3 上清的SERS与组织中常见物质的拉曼光谱对比图Fig.3 The Comparison diagram of SERS of Supernatant of homogenized tissue and Raman spectra of common materials

表1 光谱特征峰的归属及生物分子来源Table 1 Tentative biochemical assignment for the raman peaks

图4 胃癌与正常上清的典型SERSFig.4 Typical SERS of normal and malignant gastric supernatant of homogenized tissues

图5 胃癌与正常组织的典型SERSFig.5 Typical SERS of normal and malignant gastric tissues

为分析拉曼特征峰的归属，对生物中常见的几种物质：小牛胸腺DNA、胆固醇、酪氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、色氨酸的固体进行了光谱探测，并与上清的SERS进行对比（见图3），发现：相对于固体的拉曼峰，上清的SERS存在7cm－1以内的频移，特征峰的相对强度也有明显变化，这是由于当分子吸附在金纳米颗粒表面时，电荷转移使吸附分子的电子结构发生了微小变化［10］，属于化学吸附范畴。上清的SERS峰较宽，分析可见是多种物质的拉曼信号叠加的结果。可归属至DNA的 峰 有724、1 244、1 329、1 367和1 471cm－1，此 外，DNA固体PO2－的对称伸缩振动在1 098cm－1，而加入金溶胶后，组织在1 087cm－1峰比较强，可能是由于DNA单、双链发生了断裂［11］；可归属至胆固醇的有963、1 087和1 128cm－1；可 归 属 至 D－葡 萄 糖 的 有1 032、1 128和1 329cm－1；可归属至 L－苯丙氨酸的有623、828、1 002、1 032和1 597cm－1；可归属至 L－色氨酸的有623和1 367cm－1；可归属至L－酪氨酸的有828和1 329cm－1。根据上述结果及文献［3－6，11－13］，确定各特征峰的归属，如表1所示。分析图2、3和表1发现，金溶胶对组织、匀浆及上清的SERS中724、963、1 087、1 128、1 244、1 329、1 367、1 471、1 597、1 723cm－1等处的峰增强效果特别明显，这些峰主要归属于核酸、蛋白质、糖类及脂类上，尤其增强效果最为突出的724、1 471、1 597cm－1等峰可以归属至核酸的腺嘌呤。2.2胃癌与正常组织的SERS

为消除激发光能量及光谱收集效率的变化对整个光谱的影响，对光谱进行面积归一化处理，分析胃癌与正常上清、组织的SERS的差异，分别见图4和图5。从图4可以看出，相比正常上清的SERS，癌上清在623、724、1 087、1 471、1 597和1 723cm－1处峰强度较高，在828、1 002和1 032cm－1处峰强度较低。图5显示，相比正常组织，癌组织在724、1 329、1 367和1 597cm－1处峰强度较高，在828和1 002cm－1处峰强度较低。

为反映癌组织光谱强度Ic与正常组织光谱强度In的差异，利用全部病例的平均光谱，定义癌组织相对于正常组织SERS光强的相对变化率λ＝（Ic－In）／In（见表2）。分析可得，癌组织中核酸的含量较高，大部分蛋白质的含量较低，糖类及脂类的含量也较低。

表2 胃癌与正常的组织和上清主要差异特征峰光强的相对变化率（λ）。Table 2 The relative－change rate of SERS of tissues and supernatant between cancerous and normal tissues

3 讨论

以金溶胶为基底，组织、匀浆和上清的SERS的信号有明显增强，其中上清增强效果最好。组织在匀浆研磨过程中，对细胞膜有一定的损伤，造成细胞破裂，增大了金溶胶与细胞内腺嘌呤等物质的作用机会，这可能是金溶胶对组织匀浆及上清拉曼信号的增强效果远好于金溶胶直接作用于组织的原因。而组织匀浆中仍含有组织碎屑，会对纳米颗粒与物质的相互作用及光在样品中传输产生一定的影响，导致组织匀浆的SERS效果稍差于上清。匀浆及上清SERS中I1087／I1128的增大可能是由匀浆和上清中与金溶胶相互作用的核酸的量较多引起的。此外，同一种样品的SERS中，核酸腺嘌呤的增强效果最为突出，可能是由于其与金溶胶的吸附性较好，腺嘌呤常用作SERS的探针分子，其与纳米颗粒的相互作用机理目前仍是人们研究的热点问题［14］。

对胃癌和正常组织、上清SERS间的差异进行分析，发现相比于正常组织，癌组织中大部分蛋白质、糖类及脂类的含量较低，核酸的含量较高。医学研究表明，癌细胞的新陈代谢较正常细胞活跃，导致大部分的蛋白质、脂类及提供能量的糖类消耗较大，难以在组织和细胞中聚集，因而在癌组织中的含量较低［15］。癌细胞与正常细胞的区别主要体现在细胞核上，癌细胞具有无限增殖的能力，DNA大量复制，且增殖过程中可能会出现二倍体、三倍体及可见的巨核、双核、多核情况，细胞核质比增加，这些可能造成胃癌组织核酸的含量较高［11］。

4 结语

本文以金溶胶为基底，采用近红外拉曼光谱系统，对21例手术治疗的胃癌病人的癌变与正常组织的组织、匀浆及上清进行SERS探测。胃组织的SERS信号比普通拉曼信号有明显的增强，且核酸腺嘌呤的信号尤其突出，鉴于金溶胶对核酸腺嘌呤的增强作用显著的优势，SERS在癌症识别方面拥有巨大的潜力，有望成为胃癌临床诊断的一种新方法。

［1］ Nie S M，Emery S R.Probing single molecules and single nanoparticles by surface－enhanced Raman scattering［J］.Science，1997，275（5330）：1102－1106.

［2］ Kneipp Katrin，Wang Yang，Kneipp Harald，et al.Single molecule detection using surface－enhanced Raman scattering （SERS）［J］.Phys Rev Lett，1997，78（9）：1667－1670.

［3］ 刘燕楠，邹祖全，刘燕青，等.肺正常组织与癌变组织的表面增强拉曼光谱［J］.光谱学与光谱分析，2007，27（10）：2045－2048.

［4］ PInzaru S C，Andronie L M，Domsa I，et al.Bridging biomolecules with nanoparticles：surface－enhanced Raman scattering from colon carcinoma a nd normal tissue［J］.J Raman Spectrosc，2008，39：331－334.

［5］ Feng Shangyuan，Lin Juqiang，Cheng Min，et al.Gold nanoparticle based surface－enhanced Raman scattering spectroscopy of cancerous and normal nasopharyngeal tissues under near－infrared laser excitation［J］.Applied Spectroscopy，2009，63（10）：1089－1094.

［6］ Huang Zufang，Li Zuanfang，Chen Rong，et al.The application of Silver nanoparticle based SERS in diagnosing thyroid tissue［C］.［S.1.］：Journal of Physics：Conference Series 277，2011，012014：1－6.

［7］ 马君，张奚宁，徐明，等.激光诱导荧光技术在体探测裸鼠腹膜胃癌播散［J］.中国激光，2009，10（36）：2566－2570.

［8］ 马君，徐明，巩龙静，等.近红外激光拉曼技术在体探测胃癌腹膜播散［J］.中国激光，2011，38（9）：0915001－1－6.

［9］ Frens G.Controlled Nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions［J］.Nature Physical Science，1973，241（1）：20－22.

［10］ Costa J C S，Sant’Ana A C，Corio P，et al.Chemical analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons by surface－enhanced Raman spectroscopy［J］.Talanta，2006，70：1011－1016.

［11］ 许以明.拉曼光谱及其在结构生物学中的应用［M］.北京：化学工业出版社，2005：1－124.

［12］ Teh S K，Zheng W，Ho K Y，et al.Diagnostic potential of near－infrared Raman spectroscopy in the stomach：differentiating dysplasia from normal tissue［J］.British Journal of Cancer，2008，98：457－465.

［13］ 俞允，林居强，黄浩，等.银胶浓度对电穿孔获取细胞内表面增强拉曼 光谱的影响［J］.生物化学与生物物理进展，2011，38（10）：961－966.

［14］ 吴雷，李海超，赵海峰，等.基于在位光还原银胶法的表面增强拉曼散射技术检测核酸碱基［J］.分析化学，2011，39（8）：1159－1165.

［15］ Yang Jipeng，Guo Jianyu，Wu Liangping，et al.Raman spectroscopic identification of normal and maligant human stomach cells［J］.Chinese Optics Letters，2005，3（12）：705－707.