石油污染对胶州湾沉积物中微生物群落结构与功能影响的模拟研究*

李新伟，赵阳国，2＊＊，王千里，陈 敏

（中国海洋大学1.环境科学与工程学院；2.海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛266100）

近年来，随着海上运输以及沿海炼油工业的发展，溢油和漏油事故逐年增多，使受污染的海域范围不断扩展，给自然海洋生态环境安全带来巨大挑战。石油泄漏和烃类污染物的排海处置会直接导致近岸海域环境质量的严重下降，对水产和旅游业造成巨大的经济损失［1－3］。已有研究证实［4－6］，石油降解中间产物由于其潜在毒性和生物积累效应还会引起沉积物中生物多样性降低、微生物活性下降等连锁性的生态学问题，其生态危害性已经引起国内外学者的广泛注意。石油进入海洋后，石油中的一些成分可直接挥发而进入空气；一小部分海洋表面的石油受紫外线作用可发生光化学分解，但速度极慢；而大部分石油要通过物理化学作用、微生物的降解作用形成石油乳状液和石油代谢中间代谢产物，扩散进入新水体或沉积物，通过微生物的进一步代谢活动得到降解［7］。然而，一旦近海水体环境发生变化，沉积在底泥中的难降解有机物会重新释放出来进入水体，影响上覆水的水质，形成二次污染。此外，底泥又是底栖生物的主要生活场所和食物来源，污染物质可直接或间接对底栖生物或上覆水生物产生致毒致害作用，并通过生物富集、食物链放大等过程，进一步影响陆地生物和人类健康［8－9］。

海洋沉积物的污染评价一直以来是人们非常关注但难以解决的问题［10］。有研究表明，可以通过生物组织残毒和沉积物毒性测定鉴别沉积物“对人体健康或环境的危害”［11］。作为单细胞原核微生物的细菌类群，具有对环境因素改变快速响应的特点，其群落结构、功能的变异是反映沉积物污染的良好指标。Tim等［12］研究了重金属等污染物对微生物群落结构与功能的影响，结果发现，沉积物中金属污染物向水体的转移依赖于沉积物中微生物群落的生物学活性，而这种微生物群落可作为海洋污染的指标。Shane等［13］和Yakimov等［14］研究了石油类污染物对海底沉积物微生物群落结构与功能的影响，结果表明，石油烃类物质使沉积物内源微生物的石油代谢活性增强，而使微生物群落多样性降低，这种变化可以作为石油污染状况的生物指标。微生物体内参与氧化反应的酶可分为氧化酶和脱氢酶2大类，其中脱氢酶在石油降解过程中尤为重要［15］。微生物降解石油烃的过程中，石油烃通过脱氢酶活化氢原子并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化［16］。脱氢酶活性（dehydrogenase activity，DHA）可直接反映微生物降解石油的能力。该值越大表明微生物利用石油烃的能力越强，降解石油烃的速度越快［17］。为此，脱氢酶活性可以用来表征微生物降解石油的功能指标。

胶州湾是黄海西北边缘顺承陆海的过渡海湾，其石油污染日益严峻，作为污染的生态影响评价指征，沉积物中微生物群落结构与功能及对石油污染的响应特征亟需深入研究。基于此，本研究以胶州湾沉积物为对象，并模拟海底环境建立动态微宇宙模型，通过检测脱氢酶活性和细菌群落结构变化，来探讨石油烃污染物对沉积物微生物群落结构的可能影响以及微生物的响应，为海洋沉积物石油污染的生态学影响评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 沉积物的采集

2008年9月29日，应用沉积物原位采集器自胶州湾李村河口附近（120.312 5°E，36.156 4°N）获取沉积物样品，沉积物采集后置于50L塑料筒中混合均匀，运至实验室用于海洋沉积物模拟研究。沉积物基本特征为：总磷522.6mg·kg－1，总氮1 800mg·kg－1，有机氮0.18%，有机碳1.03%，有机质5.07%。

1.2 动态微宇宙模型的建立

建立2个动态微宇宙模型，用于揭示胶州湾沉积物在石油烃污染条件下，沉积物中微生物群落结构与功能的变化。模型材质为有机玻璃，圆筒状，直径80mm，高240mm，总容积1.2L，有效容积1.0L。模型中，加入0.3L稳定的胶州湾沉积物样品，上层覆盖取自胶州湾的陈海水。

模型采用底部进水、顶部出水的方式。1个模型为空白对照，进水只进陈海水；另1个模型进水为加入终浓度1 000mg·L－1乳化石油的陈海水。其中陈海水为取自胶州湾中央受陆地影响较小区域的海水，将其放置暗处贮存数周，待其所含杂质沉淀后，过滤而得到的海水。为模拟外源污染物对胶州湾沉积物的冲蚀作用以及潮汐作用，模型运行过程中顶部设有一搅拌器。模型的控制以24h为一周期，其过程为：首先搅拌器搅拌1h，然后静置1h，之后蠕动泵开始进水，进水流速为0.5mL·min－1，进水8h后，蠕动泵停止运行。此时开启搅拌器，搅拌1h，再静置沉降1h后进水，12h后停止进水。

本研究的石油污染物是原油和少量吐温－80的混合物。原油直接取自盘锦辽河油田，在加入进水前将石油与吐温－80按10∶3（w／w）比例乳化，然后加入到进水中，配成石油浓度为1 000mg·L－1的进水。吐温－80可有效分散原油液滴以强化与微生物接触，低浓度时（500mg·L－1）可协同促进微生物对多环芳烃的降解［18］。

每隔5d取模型的出水和底泥，一部分泥样和水样装于封口袋中，立即用于脱氢酶活性测定和细菌总数分析；另取3～5mL沉积物样品，－20℃保存，用于微生物分子生物学分析。

1.3 沉积物微生物群落结构与功能分析

1.3.1 脱氢酶活性（DHA） 微生物降解石油烃的过程中，石油烃通过脱氢酶活化氢原子并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化，DHA可直接反映微生物降解石油的能力［15］。本研究采用氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法测定石油降解过程中沉积物微生物脱氢酶活性［19］。定义每1mL菌液、1h氧化1μg三苯基甲臜（TPF）所需的酶量为1个酶活单位，单位是μg·g－1。

1.3.2 细菌定量分析 将稀释的沉积物样品按9∶1（v／v）加入甲醛对细菌进行固定，用 DAPI（4’，6－diamidino－2－phenylindole，4’，6－联脒－2－苯基吲哚）染色，荧光显微技术测定细菌总数。DAPI是1种灵敏度高、特异性强的荧光染料，对染色体及DNA有很好的染色效果。它可与DNA的A－T碱基结合形成DAPI－DNA复合物，该复合物在紫外激发光（365nm）下会发出蓝色荧光。甲醛固定的样品经DAPI染色时，甲醛可诱发蛋白质中的芳香乙酰基团转化为荧光色团，从而使细胞质荧光较强，由此可见整个细胞的轮廓［20］。根据文献［21］的计算公式，计算原样品中细菌总数。

1.3.3 微生物群落结构分析 采用高效土壤DNA提取试剂盒（Mobio，美国）提取沉积物总DNA。以总DNA为模板，应用细菌通用引物 BA101／BA534［22］对细菌群落结构的动态变化进行分析；以BA101／BA534扩增产物为模板，以细菌通用引物BA341／BA534［23］对石油影响下的细菌群落进行嵌套PCR，以进一步解析该条件下的细菌群落结构动态。用于DGGE分析的PCR产物，其引物BA534的5’端均带有GC夹，所用引物均购自上海Invitrogen，PCR扩增在Mycycle扩增仪（Bio－Rad Laboratories，美国）上进行。根据文献［22］的方法进行PCR扩增及对PCR产物进行DGGE分析。

应用 Gel－Pro 4.5对 DGGE图谱进行数字化，提取各条带的灰度值。根据数字化结果对DGGE图谱中各泳道微生物进行Shannon－Weiner多样性指数（H′）分析，H′通过公式H′＝－∑Pi logPi计算，其中Pi是泳道中条带的相对信号强度；采用SPSS软件（SPSS Inc.，Chicago IL）以 Ward’s方法对各泳道群落进行聚类分析。

DGGE图中条带按文献［22］方法回收并克隆测序。序列通过 RDP（http：／／rdp.cme.msu.edu／）中的SeqMatch程序以及Blast在线工具进行相似性检索。

1.4 DNA序列在基因库中的登录号

本研究获得DGGE条带序列均已经递交至Gen－Bank中，登录号为：JQ316483－JQ316495。

2 结果与讨论

2.1 沉积物中细菌数量的变化

应用荧光计数法对不同时期的沉积物细菌总数进行定量分析（见图1）。模型运行初期，由于上覆水中加入高浓度的石油，大量的细菌由于环境的迅速改变以及石油的高毒性而死亡或受到抑制，表现为细菌总数迅速降低。此后，细菌总数一直在3.0×109cell·g－1范围内波动，变化不大，表明沉积物中细菌群落经过10d左右的驯化，已经基本趋于稳定。

模型运行至第70天左右，其微生物总数有降低的趋势，可能由于时间的推移，石油降解中间产物不断积累，对微生物产生了强烈的毒害作用，使得其微生物总数降低。Vania等［24］研究了甲苯和苯在生物降解前后对网纹水蚤（Ceriodaphnia dubia）的毒害作用，发现降解前浓度为20mg·L－1的甲苯和苯对网纹水蚤的致死率分别为99%和48%，降解掉98%后对其致死率分别为33%和24%，可见生物降解并不能完全去除甲苯和苯的毒性。还有研究表明，在降解过程中生成的中间产物的毒性反而比石油污染物的毒性更大［25］。宋玉芳等［26］对沈阳东部石油污水灌渠的上、中、下游进行了污染物（Cd、矿物油）含量分析和生态毒性实验。结果表明对微生物的毒性不仅来源于石油污染物本身，还来源于石油污染物降解过程中的中间产物。

图1 细菌总数随时间变化过程Fig.1 The dynamics of total bacteria in the sediment samples

2.2 沉积物脱氢酶活性对石油污染的响应

微生物数量在一定程度上并不能准确反映微生物活性状况，利用微生物活性指标评价生物活性是十分必要的。微生物体内含有各种各样的酶，能够催化石油烃进行氧化反应，参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要［15］。微生物脱氢酶是微生物降解有机污染物、获得能量的必需酶。生物体的脱氢酶活性（DHA）在很大程度上反映了生物体的活性状态［27］。脱氢酶使石油烃的氢原子活化并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化。石油中包含有数千种不同有机分子，其主要元素是碳和氢，也含有少量的氮、氧、硫元素。在微生物作用下，其中的直链烷烃首先被氧化成醇，源于烷烃的醇在醇脱氢酶的作用下，被氧化为相应的醛，醛则通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸［24］。本实验过程中沉积物脱氢酶活性（DHA）变化见图2。

图2 脱氢酶活性随时间的动态变化Fig.2 The dynamics of DHA in the simulative sediment samples

图2 表明，随着石油的加入，沉积物中的脱氢酶活性明显升高，在实验初期，模型中的脱氢酶活性增长缓慢，模型运行到第40天左右，脱氢酶活性呈对数增长，沉积物逐渐受到石油烃刺激，烃类污染物能使具备降解能力的微生物逐渐富集［19］，石油降解菌可以利用沉积物中易降解的石油烃组分作为碳源生长，刺激石油降解菌大量繁殖，引起沉积物中的脱氢酶活性升高。比较图1和2可以看出，在脱氢酶活性增长的对数期，细菌总量稍有增多，但并不明显，这表明石油烃利用活性的升高与细菌总量的提高并不同步，主要是由于沉积物中石油降解菌数（均值为7.0×104个·g－1·dw）只占细菌总数（均值1.08×109个·g－1dw）中少部分，在这种情况下，即使石油烃降解菌的数量和活性有较大的提升，也无法在总菌数量上表现出来［28］。但到第75天左右脱氢酶活性开始有所降低，可能由于石油中间代谢产物的长时间积累，毒性逐渐加强。研究表明，在降解过程中生成的中间产物的毒性反而比石油污染物的毒性更大［25］，这就导致石油降解菌逐渐受到抑制甚至死亡。

2.3 石油污染条件下沉积物细菌群落结构的响应

分别取模型运行的第0、10、25、55、85天沉积物样品进行DGGE分析，结果发现，对照细菌群落结构并未随着时间而发生明显变化，而石油处理样品在第10、25天有较大变化（图未提供）。为了更好地显示这些差异，又应用嵌套PCR，将石油处理样品的种群差异进行放大，并进行DGGE分析。石油处理样品的DGGE图谱及对图谱进行聚类分析结果如图3，对DGGE图中部分条带进行克隆测序分析，结果如表1。

由图3－B聚类分析，可以看出第0天和第10天群落结构相似性较高，第55天和85天菌落结构相似性较高，随着石油的不断驯化，沉积物中的群落结构不断发生变化，前10天与后期群落结构的分离距离可达50%，表明石油烃对沉积物样品细菌群落的选择作用主要发生在模型运行初期，而随着模型的运行，这种选择作用逐渐减小。

图3 不同时期泥样的DGGE谱图（A）及其聚类分析（B）Fig.3 DGGE profile of samples at different times（A）and cluster analysis for DGGE profiles（B）

从图3－A 中可以看出，条带 A1、A2、A8、A11、A12、A13逐渐消失，表明这些条带由于不适应石油环境而逐渐被淘汰；而相反，条带 A3、A4、A5、A7、A10随着模型的运行，其浓度逐渐加强，并成为优势类群，表现出对石油环境的适应，同时其功能也可能得到发挥。根据测序结果的分析，这5个优势条带，序列分别同γ－变形菌纲（3条）、δ－变形菌纲（1条）和厚壁菌门（1条）中的微生物最为相似，多为分离自海洋中的非典型石油烃降解菌。可见，不同微生物对石油污染环境的适应能力是有差别的，沉积物被石油烃污染以后，烃类污染物能使具有降解能力的微生物产生诱导酶，正是通过这种自然选择以及基因突变作用，能够适应新的微生物生态环境的微生物种属，在降解烃类物质的过程中被逐渐富集成为优势菌群［20］。

通过对各泳道群落的多样性分析，发现群落的多样性是逐渐下降的，由最初的2.967降至2.154。这表明，由于石油污染进入，将引起原有沉积物微生物群落多样性的降低而特异类群的富集，这将导致生态系统组成过于单一，趋于不稳定。

根据对DGGE条带序列的分析，发现沉积物中以变形菌门（Proteobacteria）为绝对优势类群，占全部测得序列的60%左右。其中37%为γ－变形菌纲，23%为δ－变形菌纲。模型中加入石油后，这些有机化能异养菌，逐渐成为优势菌。其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和绿弯菌门（Chloroflexi）等相关序列。其中拟杆菌门（Bacteroidetes）属于革兰氏阴性菌，是兼性厌氧生物，绝大多数种属在有机物的发酵降解过程中具有重要作用。放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）都属于革兰氏阳性菌，其中很多厚壁菌可以产生芽胞，它可以抵抗脱水和极端环境。

表1 通过BLAST和SeqMatch进行的相似性检索结果Table 1 Sequence similarities to closest relatives and phylogenetic affiliations of DNA recovered from DGGE gel

续表

测序结果发现，本研究中胶州湾沉积物降解石油的微生物类群，与陈碧娥等［29］湄洲湾海域降解石油烃的天然菌群结构较为相似。另外，Margesin等［6］降解柴油的微生物研究以及周宗澄等［30］报道的厦门港石油降解菌的研究，发现其优势菌群主要为革兰氏阴性菌，也与本研究结果较为一致。

3 结语

采用脱氢酶活性分析和DGGE技术，探讨了沉积物上覆水中添加石油后沉积物中微生物功能和群落结构的响应特征，表明高浓度的石油污染对细菌总量无显著影响，但脱氢酶活性却会明显提高；石油烃污染可引起沉积物中特异微生物类群的过度富集，并导致微生物多样性明显下降。

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