化学－酶催化法制备D－谷氨酸与γ－氨基丁酸

杨成丽，马子玉，胡晓丽，李大力

（1.南京理工大学生物工程系，江苏 南京210094；2.南京农业大学微生物学系，江苏 南京210014；3.南京农业大学动物科技学院，江苏 南京210014）

L－谷氨酸脱羧酶（L－Glutamic acid decarboxylase，GAD）是一种广谱酶，可以催化L－谷氨酸（L－Glu）脱羧生成 γ－氨 基 丁 酸 （γ－Aminobutyric acid，GABA）[1］。GABA是有效的抑制性神经递质，在医药行业应用广泛，近年来在食品行业也越来越受关注[2，3］。GABA目前主要采用化学合成法、植物提取法和微生物发酵法生产，化学合成法安全性较差，植物富集的GABA含量很低，微生物发酵法主要使用含有GAD的菌种来发酵生产 GABA[3－5］。

D－谷氨酸（D－Glu）是许多药物、生物活性物质以及聚合体的重要前体和中间体，可与多种金属形成配合物，在超分子化学中也得到了广泛应用[6］。目前，DGlu的制备方法主要有手性拆分法、生物转化法两种，手性拆分法是利用手性拆分剂分离DL－Glu来生产DGlu[7］，该法工艺复杂，工业化应用难度较大。生物转化法是利用菌体或酶来转化生产D－Glu。

作者从保加利亚乳杆菌粗提得到GAD，采用酶催化法由DL－Glu制备得到了D－Glu和GABA。

1 实验

1.1 菌种与培养基

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii sp.Bulgaricus）从市售伊利原味酸奶中分离得到。接种环挑取市售伊利原味酸奶，平板划线培养，于37℃培养24h后，观察菌落形态并进行显微镜镜检，确定目的菌落。

改良LB培养基：蛋白胨2g·L－1，酵母膏5g·L－1，L－Glu 25g·L－1，pH 值6.0。

1.2 试剂与仪器

所用试剂均为国产分析纯。

WXG－4型旋光仪，上海光学仪器厂。

1.3 L－谷氨酸的消旋

参照文献[8］方法对L－Glu进行消旋。在1L圆底烧瓶中加入54.08g（0.32mmol）L－Glu、400mL乙酸和20mL蒸馏水，水浴加热并搅拌，L－Glu全部溶解后，加入4mL水杨醛于90℃搅拌反应7h，加入6g活性炭，煮沸5min，过滤，旋蒸浓缩后用1mol·L－1盐酸溶液调节pH值至3.2，过滤收集沉淀，用少量蒸馏水洗涤，干燥，即为DL－Glu。

1.4 L－谷氨酸脱羧酶粗提物的制备

将菌种接种于5mL改良LB培养基中，于37℃振荡培养18h，离心收集菌体，用蒸馏水重悬，冰浴中超声破碎菌体，加2BV冷冻丙酮，混匀后于－20℃放置10min，离心收集沉淀，即得GAD粗提物。

1.5 D－Glu与GABA的制备

将由5mL菌液制备得到的GAD粗提物、2mL 4 mmol·L－1的磷酸吡哆醛溶液、8mL 50mmol·L－1的DL－Glu（用pH 值4.4的 H3PO4－NaH2PO4缓冲溶液配制）混合均匀，于37℃反应不同时间。

反应液旋蒸浓缩后用1mol·L－1盐酸溶液调节pH值至3.2，静置后抽滤，获得D－Glu，测定旋光度，参照文献[9］计算D－Glu的光学纯度。滤液参照文献[10］加入2BV乙醇后，调节pH值至7.3，待有沉淀析出后抽滤，获得GABA，计算收率。

1.6 产物分析方法

采用薄层层析（TLC）分析反应体系中产物的形成，取一定时间的反应液在经过活化的硅胶板（G254）点样层析，展层剂为正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶3（体积比）。采用旋光仪测定谷氨酸的旋光度。

2 结果与讨论

2.1 DL－Glu的制备

实验得到 DL－Glu 38.86g，消旋率为94.92%，收率为71.9%。

2.2 D－Glu与GABA的制备

GAD能专一性催化L－Glu的脱羧反应，却不能催化D－Glu脱去羧基，因此，GAD可将DL－Glu中的LGlu转化为GABA。通过薄层层析（TLC）对反应进程进行监测，结果如图1所示。

图1 反应不同时间，DL－Glu底物反应液的TLC分析结果Fig.1 The TLC results for DL－Glu substrate solution reacted for different times

由图1可知，反应50h时，反应液点样层析后得到两个大小基本一致的点，表明酶催化反应基本完成。D－Glu收率为81%，光学纯度为93.2%。GABA收率为48.7%。产物D－Glu与GABA的TLC分析结果见图2。

3 结论

图2 产物TLC分析结果Fig.2 The TLC results for the product

采用化学－酶法制备了D－Glu和GABA。将LGlu通过化学消旋制备DL－Glu，再用GAD将DL－Glu中的L－Glu转化为GABA。用等电点沉淀法获取DGlu和GABA，所得D－Glu的光学纯度为93.2%、收率为81%，GABA收率为48.7%。

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